Zmieniono rozwój łożyska i wewnątrzmaciczne ograniczenie wzrostu u myszy transgenicznych wiążących IGF białko-1 ad

Trzy niezależne linie zostały ustalone od założycieli urodzonych po mikroiniekcji ludzkiego klonu kosmidowego IGFBP-1 (13). Wzrost i metaboliczne cechy tych linii są nie do odróżnienia. Istnieją dowody na dymorfizm płciowy w fenotypowej ekspresji nadmiaru IGFBP-1. Samce myszy wykazują znaczną hiperinsulinemię poposiłkową, ale mają prawidłową tolerancję glukozy. Profile metaboliczne i endokrynologiczne transgenicznych samic są podobne do profili kontrolnych dobranych pod względem płci, podobnie jak płodność i reproduktywność. Zwierzęta użyte w tym badaniu były krzyżówkami piątej generacji na tle CBA / Ca. Rodzinne i płodowe genotypy określono przez bezpośrednią analizę PCR lizatów tkanki proteinazy K przy użyciu kombinacji starterów F4221 (5a-CTAGGCTGATAATTCACTG-3a) i R4457 (5a-CCGTGGCTTGGCAGGAATGTAG-3a). Izolacja i analiza RNA. Całkowity RNA ekstrahowano z zamrożonej tkanki stosując RNAzol B (Biogenesis Ltd., Poole, Wielka Brytania). W przypadku analizy Northern, 20 .g całkowitego RNA poddano elektroforezie na denaturującym żelu formaldehydowym, przeniesiono do Hybond N + i sondowano z pełnej długości cDNA mysiego IGF-II znakowanego [a-32P] dCTP. Ekspresję genu hIGFBP-1 wykrywano przez odwrotną transkrypcję / PCR z użyciem pary primerów, która specyficznie amplifikuje ludzki gen IGFBP-1 (13). Rzadkie ciąże. Krycia między samicami transgenicznymi i samcami typu dzikiego (F + / M.) I krzyżem odwrotnym, tj. Samic typu dzikiego i samców transgenicznych (F. / M +), zostały ustawione w celu uzyskania tkanek płodowych i matczynych oraz płynu owodniowego w różnych etapy ciąży. Udane kojarzenie zostało wskazane przez pojawienie się wtyczki do pochwy. W południe dnia, w którym zaobserwowano korek kopulacyjny, uznano za 12 godzin po zapłodnieniu, zarodkowy dzień 0.5 (e0,5). Ciężarne samice uśmiercono przy e11.5, e14.5 i e17.5. Rejestrowano antropometryczne pomiary płodu, a próbki deciduzy, płynu owodniowego i wątroby płodowej pobierano z każdego z nich. Testy na całkowity i niefosforylowany hIGFBP-1. Całkowity hIGFBP-1 w płynie owodniowym mierzono za pomocą testu immuno-metrologicznego (Diagnostic Systems Laboratories Inc., Webster, Texas, USA). Niefosforylowany hIGFBP-1 mierzono za pomocą testu immunoradiometrycznego, który mierzy przede wszystkim niefosforylowaną izoformę IGFBP-1 (14). Oba testy wykazują absolutną swoistość dla ludzkiego IGFBP-1. Western blotting liganda. Próbki płynu owodniowego frakcjonowano przez elektroforezę w 12,5% SDS żelu poliakrylamidowym. Żel poddano elektrobloku na membranie nitrocelulozowej (Hybond C, Amersham Biosciences, Amersham, Zjednoczone Królestwo). Po przeniesieniu błona była blokowana w TBS z 0,1% Tween 20 i 1% BSA przed inkubacją z 5 x 106 do 8 x 106 cpm 125 I (3 IGF-1 przez 6 godzin. immunodetekcja hIGFBP-1. Błony zachodnich ligandów odpędzono, zablokowano w TBS 1% BSA i 0,1% Tween 20 i inkubowano przez dwie godziny z rozcieńczeniem 1: 1000 mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-hIGFBP-1 (mAb 6305; Medix Biochemica, Kauniainen, Finlandia ). Membrany przepłukano w TBS i 0,1% Tween 20 przed i po inkubacji ze skoniugowaną z peroksydazą chrzanową anty-mysim IgG. Wykrywanie chemiluminescencyjne przeprowadzono przy użyciu odczynników ECL (Amersham Biosciences) zgodnie z instrukcjami producenta. Histologia łożyska. Placenty utrwalano przez 12-16 godzin w obojętnej formalinie, przetwarzano w zautomatyzowanym przetwarzaniu tkanki i zatapiano w parafinie. Zatopione w parafinie tkanki podzielono i umieszczono na szkiełkach pokrytych poli-L-lizyną (Sigma-Aldrich, Poole, Wielka Brytania). Skrawki wybarwiono hematoksyliną i eozyną i umieszczono pod szkiełkami nakrywkowymi. Morfometrię łożyskową analizowano za pomocą pakietu oprogramowania do obrazowania naukowego Openlab (Improvision, Coventry, Wielka Brytania). Analiza statystyczna. Wyniki przedstawiono jako średnie. SEM. Porównania zostały wykonane przez ANOVA lub test t Studenta po normalizacji logarytmicznej danych nieparametrycznych. Gdzie P <0,05, ANOVA została zakończona przy użyciu testu najmniejszej znaczącej różnicy Fisher. Wykazuje ekspresję hIGFBP-1 w tkankach matki i płodu. Ekspresję hIGFBP-1 w decidua wykryto w różnych okresach ciąży, a wyniki, choć nie ściśle ilościowe, wskazują na brak wyraźnej różnicy poziomów ekspresji podczas ciąży (Figura 1a). mRNA hIGFBP-1 wykryto również w wątrobie transgenicznych płodów przy e14.5 i e17.5, ale nie u płodów typu dzikiego (Figura 1b). Trudności techniczne w pozyskiwaniu tkanek płodów innych niż wątroba i pozyskiwanie z nich wystarczających ilości RNA wykluczały analizę ekspresji hIGFBP-1 w tkankach pozawątrobowych. Figura ekspresja genu hGFFP-1 w macierzy płodowej i wątrobie płodowej [patrz też: ile kalorii ma chleb żytni, towarzystwo diabetologiczne, gimnastyka korekcyjna zestaw ćwiczeń ] [więcej w: ptd 2015, trening umiejętności społecznych scenariusz, koktajl z natki pietruszki ]