Rola CD44 w wywołanym antygenem mysim modelu eozynofilii płucnej ad

Myszy prowokowano przez donosowe podawanie 400 .g roztworu Asc w dniu 22 w celu indukcji odpowiedzi. W niektórych eksperymentach jako antygen do uczulenia przeznosowego zamiast Asc użyto roztocza Dermatophagoides farinae allergen (Der) (GREER Laboratories Inc., Lenoir, North Carolina, USA). Myszy poddano prowokacji aerozolowanym Der (800 .g) w dniu 22 w celu indukcji odpowiedzi. Dwadzieścia cztery godziny po prowokacji antygenem myszy uśmiercono za pomocą eteru dietylowego, a krew obwodową odzyskano przez krwawienie z oczodołu i tchawice odsłonięto do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL). BALF otrzymano przez płukanie płuc 5 x ml PBS. Szpik kostny został wypłukany z prawej kości udowej. Liczby komórek BALF i komórek szpiku kostnego zliczano za pomocą licznika komórek. Preparaty cytospin lub wymazu barwiono za pomocą Diff-Quik (Midorijuji, Kobe, Japonia). Zróżnicowane zliczenia komórek przeprowadzono na co najmniej 500 komórkach. Pomiar nadreaktywności dróg oddechowych. Oporność dróg oddechowych (Raw) u przytomnych myszy zmierzono za pomocą dwu komorowego systemu z pletyzmografem o podwójnym przepływie (Pulmos-I II III, MIPS, Osaka, Japonia), jak opisano wcześniej (16). Specyficzny surowiec (sRaw) mierzono przez wykrywanie przez odpowiednie czujniki przepływu powietrza doprowadzanego do przedniej i tylnej komory zgodnie z metodą opisaną przez Pennock i in. (17). Myszy prowokowano aerozolizowanym PBS lub metacholiną w wzrastających stężeniach (3,125. 50 mg / ml) przez 2 min, i odczyty pobrano i uśredniono przez 2 min. Po 2 min po każdej nebulizacji. Podawanie mAb CD44. Szczurze anty-mysie mAb CD2 KM201 (IgG1) (18) i IM7 (IgG2b) (19) oczyszczono z ich odpowiednich hybrydom przy użyciu kolumny powinowactwa białka G-Sepharose (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Szwecja). MAb anty-CD44 lub kontrolne szczurze IgG (300 .g w 500 .l soli fizjologicznej) podano dootrzewnowo 12 godzin przed prowokacją donosowym antygenem. Kwantyfikacja cytokin i chemokin w BALF. Ilości IL-4, IL-5 (Endogen Inc., Woburn, Massachusetts, USA), IFN-y, eotaksyna / CCL11 oraz grasica i regulowana aktywacja chemokina (TARC; CCL17) (R & D Systems Inc., Minneapolis , Minnesota, USA) w badaniu BALF mierzono za pomocą dostępnych w handlu zestawów ELISA. Stężenie leukotrienów cysteinylu oznaczano stosując zestawy do oznaczania immunologicznego enzymu leukotrienowego (EIA) (Pharmacia Biotech AB). Szczura antyserum przeciwko leukotrienom miała następujące reaktywności krzyżowe: LTC4 (100%), LTD4 (100%), LTE4 (70%) i LTB4 (0,3%), ale nie prostaglandyna PGD2 (<0,006), prostaglandyna PGE2 (< 0,006) lub tromboksanu B2 (<0,006). HA mierzono za pomocą zestawu do oznaczania białka wiążącego kanapkę (Chugai Pharmaceutical Co. Ltd., Tokio, Japonia). Czułość tego zestawu wynosiła 10 ng / ml. Granice wykrywalności wynosiły odpowiednio 7,8, 7,8, 1,0, 7,8, 7,8 i 60 pg / ml dla IL-4, IL-5, IFN-a, TARC, eotaksyny i leukotrienów. Oznaczanie ilościowe rozpuszczalnego CD44 w surowicy i BALF. Ilości rozpuszczalnego CD44 w surowicy i BALF mierzono za pomocą testu ELISA, jak opisano uprzednio, z niewielkimi modyfikacjami (20). Pokrótce, po powlekaniu .g / ml mAb KM114 w temperaturze 4 ° C przez noc, płytki ELISA przemyto PBS zawierającym 0,1% Tween i zablokowano 5% beztłuszczowego mleka w proszku. Standardy lub niewiadome zostały następnie dodane w dwóch studzienkach i inkubowane w 37 ° C przez 30 min. Urywane białka inkubowano następnie z biotynylowanym mAb IM7, i po przemyciu inkubowano je ze streptawidyną-HRP. ELISA opracowano z substratem (bufor octanu sodu zawierający tetrametylobenzydynę). Absorbancję następnie odczytano przy 450 nm za pomocą czytnika płytek. Jako standard stosowano rozpuszczalne białko fuzyjne zawierające zewnątrzkomórkową domenę mysiego hemopoetycznego CD44 i region zawiasowy, CH2 i CH3 ludzkiej IgG1 (21). Immunofluorescencja i cytometria przepływowa. Splenocyty usunięto z myszy traktowanych mAb anty-CD44, KM201 i IM7 (300 .g) lub normalnej szczurzej IgG (300 .g) i zubożono w krwinki czerwone. Ekspresję powierzchni komórkowej CD44 badano stosując mAb anty-CD44, KM114-FITC (szczurzy IgG1) (18). Epitop CD44 wykrywany przez KM114 nie był poddawany reakcji krzyżowej z wykrytymi przez IM7 lub KM201 (dane nie przedstawione). Szczur IgG1-FITC zastosowano jako kontrolę dopasowaną pod względem izotypu. Komórki pęcherzykowe w BALF otrzymano od myszy traktowanych mAb anty-CD44 (KM201 i IM7) lub normalnej szczurzej IgG. Zostały one wybarwione KM114-FITC i F4 / 80-PE (Caltag Laboratories Inc., Burlingame, California, USA), a następnie ekspresja CD44 na pęcherzykowych makrofagach była porównywana pomiędzy każdą grupą eksperymentalną bramkującą komórki F4 / 80-dodatnie. Komórki testowano pod kątem wiązania HA za pomocą cytometrii przepływowej po barwieniu ze skoniugowanym z fluoresceiną HA (FL-HA) (22) w obecności lub nieobecności mAb anty-CD44, IRAWB14, o którym wiadomo, że ma zwiększony wpływ na zdolność wiązania HA komórek (23) [patrz też: ile kalorii ma chleb żytni, ostre zapalenie migdałków, ergonomia stanowiska pracy biurowej ] [więcej w: ergonomia stanowiska pracy biurowej, ile kalorii ma chleb żytni, gimnastyka korekcyjna zestaw ćwiczeń ]