Następnie skrzyżowaliśmy myszy Ube3aStop / p + z indukowalną tamoksyfenem linią myszy CreERT + (17) w celu określenia skuteczności reaktywacji Ube3a na późniejszych etapach rozwoju pourodzeniowego. W szczególności indukowaliśmy reaktywację genu Ube3a po 3 tygodniach (u myszy nieletnich.), 6 tygodniach (myszy. U nastolatków.) I w wieku 14 tygodni (myszy. Dorosłe.), Z testami behawioralnymi przeprowadzonymi w średnim wieku 16 tygodni. Odpowiednio 22 tygodnie i 28 tygodni (ryc. 2A). W tych punktach czasowych rozwoju poziomy białka UBE3A u myszy Ube3aStop / p +, CreERT + traktowanych tamoksyfenem przywrócono do 70%> 100% poziomów typu dzikiego, co jest porównywalne z poziomem uzyskanym przez wczesną reaktywację embrionalną (Figura 2, B. D Dodatkowa Figura 2 i Figura 1B). Co ważne, ekspresja UBE3A u myszy Ube3aStop / p +, CreERT + traktowanych podłożem była również podobna do obserwowanej w Ube3aStop / p +; Cre. i myszy Ube3am p / p + (Figura 2D i dodatkowa Figura 3), demonstrując ścisłą kontrolę reaktywacji genu. Nieletnia reaktywacja Ube3a spowodowała całkowite uratowanie deficytu koordynacji ruchowej. W przeciwieństwie do tego reaktywacja nastolatków tylko częściowo uratowała koordynację ruchową, podczas gdy nie zaobserwowano poprawy w przypadku reaktywacji u dorosłych (Figura 3A). Łącznie wyniki te wskazują na krytyczny okres rozwoju motorycznego zależnego od Ube3a, który kończy się między 3 a 6 tygodniem po porodzie. Rycina 3 Reaktywacja pourodzeniowa ekspresji Ube3a ujawnia krytyczny okres dla ratowania behawioralnego. (A. E) Testy behawioralne u myszy miotowych Ube3aStop / p + i WT traktowanych albo nośnikiem (Vehicle.) Albo tamoksyfenem (Tamox.) Wykazują wyraźne krytyczne okresy dla odzyskania deficytów behawioralnych. Liczby myszy (WT, CreERT + Vehicle / WT, CreERT + Tamox./Ube3aStop/p+;CreERT+ Veh./Ube3aStop/p+;CreERT+ Tamox.): (A) Przyspieszenie rotarod po młodzieńczym (n = 22/20/22/22 ), adolescencja (n = 11/11/10/11) i dorosła (n = 11/9/12/13) reaktywacja genu. (B) Test zakopywania marmuru po młodzieńczej (n = 21/20/20/20), młodzieńczej (n = 20/20/21/23) i dorosłej (n = 13/11/14/15) reaktywacji genu. (C) Test otwartego pola po reaktywacji genów młodocianych (n = 21/21/22/22), adolescentów (n = 11/11/10/11) i dorosłych (n = 10/8/9/10). (D) Badanie budowy gniazda po młodzieńczej (n = 12/13/14/13), adolescencji (n = 14/13/16/17) i dorosłej (n = 9/8/9/8) reaktywacji genu. (E) Wymuszona próba pływania po młodzieńczej (n = 17/19/18/19), adolescencji (n = 11/11/10/11) i dorosłej (n = 11/8/9/9) reaktywacji genu. Wszystkie dane reprezentują średnią. SEM. Do porównań statystycznych zastosowano dwuczynnikową ANOVA lub powtarzalne pomiary 2-drożnej ANOVA z genotypem i traktowaniem jako zmiennymi niezależnymi. Istotny wpływ genotypu został zidentyfikowany we wszystkich testach behawioralnych (patrz Tabela dodatkowa 2). ** P <0,01 dla znaczenia genotypu. Krytyczne okno do ratowania deficytów koordynacji ruchowej różniło się od okna ratowania fenotypów związanych z autyzmem i lękiem, takich jak zadanie zakopywania marmuru, test otwartego pola, test budowy gniazda i test wymuszonego pływania, który można uratować poprzez reaktywację embrionalną ( Figura 1, D. G i dodatkowa Tabela 1), ale nie przy ponownej aktywacji młodzieńczej, młodzieńczej lub dorosłej (Figura 3, B. E i Tabela Uzupełniająca 2). Fenotyp epilepsji był także oporny na reaktywację Ube3a po urodzeniu, ponieważ drgawki utrzymywały się pomimo reaktywacji genu w wieku młodzieńczym (Figura 4A). Następnie staraliśmy się potwierdzić, czy fenotyp epilepsji u myszy AS odmiennie reaguje na leczenie lekami przeciwpadaczkowymi (AED) u myszy z reaktywacją Ube3a. Dorosły (> 8 tygodni) Ube3am. / P + i Ube3aStop / p +; CreERT. myszy leczono przez 5 dni walproinianem lub klonazepamem, stosując projekt obejmujący osobniki. Przed leczeniem każda mysz z AS wykazała napady audiogeniczne (Figura 4B). Jednakże, po 5 dniach leczenia którymkolwiek z tych LPP, u wszystkich myszy całkowicie uniknięto napadów. Ponadto, 3 dni po zaprzestaniu leczenia AED (okres wymywania), wszystkie myszy z AS ponownie wykazywały napady audiogeniczne (Figura 4B). Dane te potwierdzają, że napady można z powodzeniem leczyć u dorosłych myszy AS za pomocą konwencjonalnych leków przeciwpadaczkowych, ale są one jednak niewrażliwe na reaktywację Ube3a po urodzeniu. Figura 4 Reaktywacja u U3a u młodych zwierząt nie powoduje poprawy podatności na padaczkę, ale zabezpieczenie Schaffera CA1 LTP jest w pełni odzyskane. (A) Podatność na padaczkę u myszy Ube3aStop / p +; CreERT + utrzymuje się po reaktywacji genu Ube3a w wieku młodzieńczym (n = 8 myszy / grupę). (B) Indukcja napadów toniczno-klonicznych indukowanych przez audiogenną stymulację (wskazaną czerwonymi strzałkami) jest skutecznie leczona przez podawanie AED (niebieski prostokąt ilustruje podawanie leku i okres wymywania) u dorosłych Ube3aStop / p +; Cre. (n = 2) i Ube3am