Przywrócenie Ube3a identyfikuje wyraźne okna rozwojowe w mysim modelu syndromu Angelmana ad 6

To rozróżnienie nie tylko podkreśla wyjątkowe wymagania neurorozwojowe dla Ube3a i Mecp2, ale także ilustruje znaczenie systematycznego badania specyficznych dla choroby modeli przedklinicznych, bez względu na to, jak fenotypowo są podobne, kiedy celem jest dokładne poinformowanie badań terapeutycznych i badań klinicznych u ludzi. Metody Dalsze szczegóły podano w Dodatkowych metodach. Myszy. We wszystkich eksperymentach behawioralnych poza testem padaczki, krzyżowaliśmy samice myszy Ube3aStop / p + (na tle 129S2 / SvPasCrl, Charles River) z myszami TgCAG-Cre (13) (określanymi tutaj jako Cre + myszy) lub z Tg (CAG-cre / Esr1 *) 5Amc / J (The Jackson Laboratory) (17) (tutaj określane jako CreERT +), oba utrzymywane na tle C57BL / 6J (Charles River), w celu wytworzenia heterozygotycznych mutantów Ube3aStop / p +, Cre + i Ube3aStop / p +, CreERT + i kontrolki z miotu na tle hybrydowym F1 129S2-C57BL / 6. Leczenie tamoksyfenem. Jednodniowe do 8-miesięcznych myszy Ube3aStop / p + i ich myszy z miotu WT (obie płci) zastosowano w tym badaniu. Mutanty Ube3aStop / p +; CreERT + i myszy WT otrzymały tamoksyfen w celu zaindukowania delecji kasety Stop, w której pośredniczy Cre. Tamoksyfen (Sigma-Aldrich) rozcieńczono w oleju słonecznikowym w stężeniu 20 mg / ml. Każda mysz otrzymywała 0,10 mg tamoksyfenu na gram masy ciała, przez codzienne wstrzyknięcie ip. Grupy kontrolne leczono codziennymi zastrzykami ip oleju słonecznikowego (nośnik). Noworodkowa grupa otrzymywała tamoksyfen przez mleko matki, która otrzymywała codzienne iniekcje tamoksyfenu przez 5 kolejnych dni, poczynając od dnia porodu. Grupy młodzieży, młodzieży i dorosłych otrzymywały 7-dniowe iniekcje ip tamoksyfenu. Analiza behawioralna. Wszystkie eksperymenty behawioralne przeprowadzono podczas okresu świetlnego cyklu. Eksperymentator pozostawał ślepy na genotyp i leczenie aż do ostatecznej analizy statystycznej. W celu przyspieszenia testu rotarod myszy otrzymywały dwie próby dziennie z 45 do 60 minut interwałem próbnym przez 5 kolejnych dni. Maksymalny czas trwania próby wyniósł 5 minut. Do testu zakopywania w marmurze, czyste klatki Makrolon (50 x 26 x 18 cm) wypełniono materiałem ściółkowym o grubości 4 cm i 20 szklanych kulek, które rozmieszczono w równej odległości siatce 5 x 4. Zwierzęta miały dostęp do marmurów przez 30 minut. Kulki pokryte ponad 50% przez ściółkę zostały ocenione jako zakopane. Do testu w otwartym polu myszy umieszczono w jasno oświetlonym okrągłym polu o średnicy 120 cm przez 10 minut. Do testu budowy gniazda myszy trzymano pojedynczo przez okres 5. 7 dni przed rozpoczęciem eksperymentu. Następnie do klatki dodano 12 g ekstra grubej bibuły filtracyjnej (Bio-Rad), a niewykorzystany materiał gniazdowy ważono przez 5 kolejnych dni. Na tej podstawie określono procent wykorzystanego materiału do zagnieżdżania. Do wymuszonego testu pływania myszy umieszczono na 6 minut w cylindrycznym przezroczystym zbiorniku (średnica 18 cm) z wodą (w 26 ° C . ° C). Czas trwania bezruchu oceniano podczas ostatnich 4 minut testu. Do testu na epilepsję używaliśmy myszy na tle 129 / Sv, ponieważ podatność na padaczkę u myszy AS zależy od tła genetycznego (16). Audiogeniczne napady padaczkowe zostały wywołane przez energiczne drapanie nożyczek przez metalową kratę pokrywy klatki. Dokonano tego przez 20 sekund lub krócej, jeśli przed tym czasem wystąpił napad toniczno-kloniczny. Elektrofizjologia. Po testach behawioralnych zwierzęta uśmiercono, a hipokampalne plasterki strzałkowe (400 .m) uzyskano przy użyciu wibratomu. Pozakomórkowe zapisy w polu uzyskano w zanurzonej komorze rejestracyjnej i perfundowano w sposób ciągły sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF). LTP wywołano za pomocą protokołu 10 theta (10 ciągów 4 bodźców przy 100 Hz, w odstępie 200 ms), wykonanych przy dwóch trzecich maksymalnego potencjału postsynaptycznego polowego pobudzenia (fEPSP). Analiza Western blot. Błony nitrocelulozowe sondowano przeciwciałami skierowanymi przeciwko E6AP (E8655 Sigma-Aldrich; 1: 1000) i aktynie (MAB1501R, Millipore; 1: 20 000). Sprzężone z fluoroforem kozie przeciwciało anty-mysie (IRDye 800CW, Westburg, 1: 15 000) zastosowano jako przeciwciało drugorzędowe, a białko oznaczono ilościowo za pomocą oprogramowania Odyssey Scanner LI-COR i oprogramowania Odyssey 3.0. Immunohistochemia. Mrożone skrawki o grubości 40 mikrometrów poddano działaniu peroksydazy wodorowej (H2O2), umieszczono w roztworze blokującym (10% normalnej surowicy końskiej [NHS], 0,5% Triton X-100) przez godzinę i inkubowano przez noc z pierwszorzędowym przeciwciałem (mysz A-E6AP [E8655 Sigma-Aldrich, 1: 2000] w 2% NHS, 0,5% Triton X-100). Następnego dnia plastry inkubowano z drugorzędowym przeciwciałem (mysi HRP, Dako, 1: 200), który został wykryty przez DAB jako chromogen. Statystyka Wszystkie dane przeanalizowano statystycznie za pomocą oprogramowania IBM SPSS, a wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za znaczące. Analizę statystyczną przeprowadzono z zastosowaniem jednoczynnikowej ANOVA lub 2-drożnej ANOVA z porównaniem post-hoc Bonferroniego. Zatwierdzenie badania. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Holenderski Komitet Eksperymentów na Zwierzętach (Dierexperimenten commissie [DEC]) i zgodnie z holenderskimi przepisami dotyczącymi pielęgnacji i użytkowania zwierząt. Materiały uzupełniające Przegląd danych uzupełniających Podziękowania Ta praca została wsparta dotacjami z Fundacji Angelman Syndrome (ASF), Fundacji Simonsa (SFARI, nagroda 275234) dla Y. Elgersma i Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO-ZoN-MW) dla Y Elgersma i B. Distel. Jesteśmy wdzięczni Holendrom (Prader-Willi / Angelman Vereniging [PWAV]), Włochom (Organizzate Sindrome di Angelman [OR.SA]) i Francuzom (Association Française du syndrome d. Angelman [AFSA]) wsparcie do generowania myszy. S. Silva-Santos był wspierany przez Fundaç. O para a Ci. Ncia e Tecnologia i Fundaç. O Amélia de Mello. CF Bruinsma była wspierana przez Fundację Nina. Dziękujemy Minetta Elgersma, Jolet van de Bree, Erica Goedknegt i Sanne Savelberg za pomoc techniczną. Przypisy Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J Clin Invest. 2015; 125 (5): 2069-2076. doi: 10.1172 / JCI80554.
[przypisy: ptd, koktajl z natki pietruszki, towarzystwo diabetologiczne ]
[podobne: skoki spadochronowe łódź, rozgrzewka przed ćwiczeniami, jogurt naturalny przepis ]