Przeprogramowanie RNA przez RNA za pomocą transkrybowania RNA za pośrednictwem splicosomów ad 6

Pomimo tych wcześniejszych rozważań, wydajność PTM powinna zostać znacznie zwiększona w celu zwiększenia użyteczności tych odczynników. Do tej pory najbardziej znaczące ulepszenia w aktywności zostały wprowadzone poprzez zwiększenie długości domeny wiążącej (12, 13). Krótkie domeny wiążące, które mogą być optymalne do tworzenia łodyg in vitro, prawdopodobnie tworzą niestabilne pędy in vivo z powodu helikaz jądrowych (17), podczas gdy długie domeny wiążące prawdopodobnie stabilizują interakcję PTM-cel. Należy przeprowadzić rygorystyczne badanie wpływu długości i składu wiążącej domeny na efektywność. Aby zwiększyć wydajność trans-splicingu, PTM można modyfikować poprzez włączenie elementów wzmacniających splicing, korzystnie tych znajdujących się w intronach (30). Dodatkowo kierowanie na 3. spliczyć PTM witryny na stronie w pobliżu pre-mRNA 5. miejsce splicingu wykorzystywałoby kinetykę kotranscriptowego splicingu i prawdopodobnie zwiększyłoby efektywność (27). Drugim istotnym problemem, który można rozwiązać w systemach modelowych hodowli tkankowej, jest specyfika. Syntezie niespecyficznych produktów po wprowadzeniu PTM do komórek może pośredniczyć nieodpowiednia bezpośrednia ekspresja produktów kodowanych PTM lub nieeklarowane trans-splicing do nieistotnego komórkowego pre-mRNA lub do niewłaściwych miejsc składania w obrębie docelowego pre-mRNA. Wszystkie te typy produktów zaobserwowano w komórkach wyrażających PTM (10. 12). Aby zmniejszyć bezpośrednią syntezę niepożądanych produktów, PTM zmodyfikowano w celu zmniejszenia fałszywej inicjacji translacji (10, 12). Aby zapobiec niespecyficznemu transkrybowaniu do pre-mRNA, zaprojektowano kilka modyfikacji. PTM zaprojektowano w taki sposób, że miejsca splicingowe były blokowane przez strukturę łodygi, aż domena wiążąca była zaangażowana w docelowy pre-mRNA. Te PTM skutecznie zmniejszyły niespecyficzne trans-splicing in vitro i in vivo w niektórych przypadkach (9, 10), ale nie w innych (11). Zwiększenie rozmiaru domen wiążących do ponad 200 nukleotydów radykalnie zmniejszyło stosunek nieswoistego do swoistego trans-splicingu w systemie modelowym LacZ (12). Porównania między badaniami nie były łatwe, ponieważ do pomiaru swoistości reakcji trans-splicingu użyto różnych metod (11, 12). Konieczna będzie wyraźna poprawa swoistości, aby zapobiec tworzeniu się niechcianych chimerycznych białek, z których niektóre mogą być toksyczne i / lub immunogenne. Mimo że badania nad hodowlą tkankową ujawniają wiele nierozwiązanych problemów, oczywistym jest, że SMaRT może naprawiać mRNA i przywracać białka i ich aktywność w komórkach ssaków. Przywrócenie funkcji komórek ssaków w hodowli jest zachęcające i dostarczyło bodźca do eksploracji SMaRT w zwierzęcych modelach ludzkiej choroby. Eksperymenty w systemach modeli zwierzęcych Krytycznym etapem w ocenie każdego nowego leku jest jego zdolność do wykonywania w modelach zwierzęcych. Takie badania rozpoczęły się niedawno w SMaRT i choć jest dość wcześnie, warto podsumować kilka raportów. Pierwszą demonstracją SMaRT u zwierząt było ukierunkowanie endogennych transkryptów CGB w heteroprzeszczepach nowotworów H1299 u nagich myszy (9). Chociaż uzyskano bardzo niskie poziomy trans-splicingu, to doświadczenie pokazało, że SMaRT można osiągnąć u zwierzęcia. Niedawno zgłoszono dwa ekscytujące wydarzenia. SMaRT zastosowano do częściowej korekty defektu CFTR w 50-milimetrze ludzkiego ksenoprzeszczepu oskrzelowego CF u nagich myszy (13). Poziom Cl. przepuszczalność uzyskana za pomocą SMaRT była zgodna z aktywacją CFTR przy 22% obserwowanej w normalnych heteroprzeszczepach oskrzelowych (13). SMaRT został również użyty do częściowego odtworzenia defektu czynnika VIII w systemie myszy z mysią hemofilią (31). Poziomy krążącego czynnika VIII zwiększono z zasadniczo niewykrywalnych poziomów do 12% poziomów stwierdzonych u normalnych myszy. Poziom przywrócenia CFTR i czynnika VIII u tych zwierząt jest wystarczający dla znaczącego efektu terapeutycznego (13). Oba te badania analizowały jednak przeprogramowanie mRNA w przejściowych testach, pozostawiając bez odpowiedzi pytania dotyczące trwałości naprawy SMaRT. Niemniej jednak, badania te stanowią obiecujący początek i powinny szybko zostać poddane ocenie długoterminowej wydajności, specyficzności i bezpieczeństwa w tych i innych systemach modeli zwierzęcych. Chociaż artykuł z serii Perspective nie koncentruje się na kwestii dostarczania, należy zauważyć, że trans-splicing może prowadzić do kilku zalet w porównaniu z konwencjonalną terapią genową. Po pierwsze, technologie trans-splicingu nie wymagają wprowadzenia kompletnych sekwencji genów. W rzeczywistości, reakcje wymiany wewnętrznego egzonu mogą spowodować naprawę zmutowanego egzonu z dostarczeniem PTM krótszych niż 250 nukleotydów
[podobne: ostre zapalenie migdałków, rezonans magnetyczny otwarty warszawa, rozgrzewka przed ćwiczeniami ]
[podobne: towarzystwo diabetologiczne, sympozjum diabetologiczne zakopane 2015, komputerowy dobór fryzur ]