Przeprogramowanie RNA przez RNA za pomocą transkrybowania RNA za pośrednictwem splicosomów ad 5

Oznacza to, że wraz ze wzrostem poziomu przeprogramowanego mRNA, poziom wadliwego mRNA spada. Zmniejszenie poziomu defektywnego mRNA może być bardzo użyteczne w przypadku dominujących mutacji. PTM muszą być dostarczane do jądra komórek, aby znaleźć docelowe pre-mRNA. PTM można wprowadzić bezpośrednio do jądra lub zsyntetyzować w jądrze z szablonów DNA. Synteza z szablonów DNA była jak dotąd najbardziej udana (9. 13). Szablony PTM muszą być dostarczone do jądra, co jest wymogiem, z którym łączy się większość terapii genowych. Poza dostarczaniem jądra, skuteczne trans-splicing PTM zależy od znalezienia docelowego pre-mRNA jako powstającego transkryptu (27). W związku z tym idealny szablon PTM byłby domem do domeny transkrypcyjnej docelowego pre-mRNA, syntetyzując PTM w miejscu docelowym pre-mRNA lub bardzo blisko niego. Chociaż ten wyidealizowany typ lokalizacji jądrowej jeszcze nie został osiągnięty, celowanie PTM w żywych komórkach badano przy użyciu systemów hodowli tkankowej (9. 13). SMaRT w żywych komórkach Ukierunkowany SMaRT został po raz pierwszy osiągnięty in vitro w połowie lat 80. (29, 30). Te wczesne eksperymenty sugerowały, że tethering dwóch partnerów w reakcjach trans-splicingu znacznie zwiększyłby szybkość splicingu. Sugerowano, że reakcje trans-splicingu zachowują podobny mechanizm do tego obserwowanego w konwencjonalnym spajaniu cis, tj. Dwie reakcje przenoszenia fosforylu (Figura 2). Chociaż badania te wykazały, że spliceosomy mogą kierować ukierunkowane trans-splicing in vitro, pozostaje pytanie, czy możliwe byłoby wykorzystanie SMaRT do przeprogramowania konwencjonalnego ludzkiego mRNA w żywej komórce. W 1999 r. Puttaraju i in. wykazali po raz pierwszy, że PTM może być użyty do przeprogramowania mRNA ludzkiego kosmonukleotydu gonadotropiny (CGB) w ludzkich komórkach nowotworowych H1299 (9). Reakcja trans-splicingu była dokładna, wytwarzając chimerycznego przekaźnika między transkryptem CGB a domeną kodującą PTM, która kodowała podjednostkę A toksyny błoniczej (DT-A). Dowody na to, że mRNA chimerycznego CGBa DT-A były funkcjonalne, pochodziły z badań toksyczności (4). Bezpośrednie dowody na funkcjonalną rekonstrukcję mRNA uzyskano przy użyciu komórek HEK 293 skonstruowanych tak, aby zawierały wadliwy gen LacZ. Ten defektywny gen LacZ był celem dla SMaRT, ponieważ był on podzielony przez intron pochodzący z ludzkiego genu transbłonowego promotora konformacyjnego fibrobielenia (CFTR) (9, 12) (Figura 5). Defekt w genie LacZ został zaprojektowany przez włączenie dwóch w obrębie ramki kodonów stop w drugim eksonie, co spowodowało, że gen nie był zdolny do kierowania syntezą P-galaktozydazy (Figura 6). Nie tylko defekt mRNA LacZ naprawiono przez SMaRT, ale komórki transfekowane odpowiednią PTM wytworzyły białko o pełnej długości p-galaktozydazy i wykazywały aktywność p-galaktozydazy (12). Chociaż był to pierwszy raport o przywróceniu endogennej struktury białka i funkcji przez trans-splicing w komórkach ssaków, to jednak przeprogramowano sztuczny gen o bardzo prostej strukturze. Aby przetestować użyteczność SMaRT w przeprogramowaniu ludzkiego genu o znaczeniu klinicznym, opracowano PTM do naprawy mRNA CFTR (10). Ostatnie i bardzo zachęcające wyniki pokazują, że PTM ukierunkowane na endogenny pre-mRNA CFR-508 prowadzą do naprawy mRNA i częściowej odbudowy Cl. wady transportowe ludzkich komórek nabłonka dróg oddechowych człowieka w hodowli (13). Geny kodujące naprawcze PTM dostarczano przy użyciu wektorów adenowirusowych. Przy wielości infekcji 2000 cząstek / komórki wirusa, Cl. stwierdzono, że prąd wynosi od 12% do 16% obserwowanego w hodowlach nabłonkowych spoza CF (13). Ten poziom korekty wystarczyłby na odpowiedź terapeutyczną (13, 19). Badania te wyraźnie pokazują, że SMaRT może być użyty do przeprogramowania mRNA i przywrócenia lub zmiany struktury i funkcji białka w żywych komórkach. Badania nad systemami hodowli tkankowej podkreślają również znaczenie dwóch kluczowych kwestii: wydajności i swoistości (patrz także dyskusja w odnośniku 19). Jak dobrze działa SMaRT w żywych komórkach. W doświadczeniach ukierunkowanych na pre-mRNA LacZ w komórkach HEK 293, skuteczność trans-splicingu mierzono na poziomie 2% poziomów mRNA LacZ (12). Pomiar ten przeprowadzono za pomocą ilościowej metody RT-PCR w czasie rzeczywistym opracowanej przez Baker i współpracowników (12). Poziom naprawy białka był trudniejszy do oszacowania, ale poziom poniżej 1% został oszacowany dla korekty białka CFTR (patrz dyskusja w odnośniku 13). Chociaż te liczby dla mRNA i korekty białka są niskie, wpływ na enzymatyczne przywrócenie CFTR był znacznie wyższy (12-16%) (13). Chociaż widoczna różnica między poziomami białka i Cl. Zależnych Cl. transport może wskazywać, że tylko pomiary aktywności są istotne dla określenia skuteczności, więcej przypadków należy poddać analizie ostrożnie, aby prawdziwie oszacować skuteczność SMaRT
[więcej w: trening umiejętności społecznych scenariusz, ostre zapalenie migdałków, brak szczęścia w miłości ]
[przypisy: polskie towarzystwo diabetologiczne, identyfikator uczestnika zjazdu, zjazd ptd 2015 ]