Prozapalny peptyd Helicobacter pylori aktywuje monocyty w celu wywołania dysfunkcji limfocytów i apoptozy ad

Monocytom pozwolono na migrację przez filtry, a kumulację komórek w dolnych przedziałach określono mikroskopowo po 90-minutowej inkubacji w 37 ° C. Aktywność NADPH-oksydazy określono stosując system chemiluminescencji wzmocnionej izotuminolem (CL), który określa ilościowo reaktywne formy tlenu zewnątrzkomórkowego (ROS) (13). Testy apoptozy. Apoptozę monitorowano za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano w innym miejscu (14). Limfocyty T lub komórki NK bramkowano po ekspozycji na monocyty, a bramkę ustawiono tak, aby zawierała limfocyty o zmniejszonym rozpraszaniu do przodu i zwiększoną rozpraszalność kąta prostego apoptozy (12). Zastosowano dwie dodatkowe metody w celu określenia apoptozy w komórkach NK i limfocytach T: analiza pęknięć nici DNA za pomocą testu TUNEL i barwienia aneksyną V, jak opisano w innym miejscu (14, 15). Wykrywanie powierzchni limfocytów i antygenów wewnątrzkomórkowych. Milion komórek barwiono odpowiednimi skoniugowanymi z FITC i fikoerytryną mAb (sprzężonym z PE) (Becton Dickinson, Sztokholm, Szwecja, 10 ul / 106 komórek), jak opisano w innym miejscu (15). Komórki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej na FACSorcie z oprogramowaniem Lysys II (Becton Dickinson). Limfocyty były bramkowane na podstawie rozproszenia do przodu i do kąta prostego. Szybkość przepływu skorygowano do mniej niż 200 komórek x s (1 i analizowano co najmniej 5 × 103 komórek dla każdej próbki. Limfocyty analizowane pod kątem CD3. ekspresja była najpierw wybarwiona dla odpowiednich antygenów powierzchniowych. Następnie, komórki utrwalono i permeabilizowano przy użyciu zestawu Cytofix / Cytoperm Kit (Becton Dickinson) i inkubowano z mAb sprzężonym z PE przeciwko CD3. (TcRa / TIA-2, Immunotech / Coulter, Marsylia, Francja) zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Na koniec komórki analizowano pod kątem CD3. ekspresję za pomocą cytometrii przepływowej. Badanie cytotoksyczności komórek NK. Cytotoksyczność, w której pośredniczy komórka NK, przeciwko K562, komórce białaczkowej leukemii wrażliwej na komórki NK, badano jak opisano w innym miejscu (14). Limfocyty wzbogacone w komórki NK (100 000 komórek / studzienkę) inkubowano w czterech powtórzeniach w 96-studzienkowych mikropłytkach (Nunc A / S, Roskilde, Dania) w obecności lub pod nieobecność autologicznych monocytów (10000. 100 000 komórek / studzienkę). Wszystkie związki dodawano na początku inkubacji, z wyjątkiem formylmethionyl-leucylo-fenyloalaniny (fMLF; 0,1 .M) lub Hp (2 20) (50 .M), które dodano 20 minut później. W końcu do zawiesiny komórek dodano 10 000 komórek obciążonych 51Cr (Amersham, Sztokholm, Szwecja) K562. Po inkubacji w 37 ° C przez 16 godzin, supernatantowe płyny zebrano za pomocą systemu zbierania tkanek (Amersham) i oznaczono radioaktywność w liczniku gamma. Cytotoksyczność komórek NK obliczono za pomocą wzoru: Równanie 11 Cytozol [Ca2 +] w komórkach HL-60 wyrażających FPRL1, FPRL2 i FPR. Stabilną ekspresję FPR, FPRL1 i FPRL2 w niezróżnicowanych komórkach HL-60 uzyskano jak opisano, a ich interakcję z Hp (2. 20) określono przez zdolność peptydu do mobilizacji wewnątrzkomórkowego [Ca2 +] w komórkach naładowanych fura 2. (16). Wyniki Peptyd H. pylori podobny do cekropiny aktywuje ludzkie monocyty Chemotaksja i aktywność NADPH-oksydazy. Stwierdzono, że peptyd Hp (2. 20) jest chemotaktyczny w stosunku do monocytów w zależności od dawki (Figura 1a). Maksymalna obserwowana transmigracja była tylko nieznacznie niższa niż ta wywołana przez dobrze scharakteryzowany i skuteczny chemoatraktant monocytów fMLF. Chemotaktanty monocytów zwykle aktywują wyspecjalizowany system transportu elektronów, oksydazę NADPH, która przenosi elektrony do tlenu cząsteczkowego. W ten sposób tlen zostaje zredukowany do anionów ponadtlenkowych, które z kolei zamieniają się w toksyczne produkty tlenowe (17). Peptyd Hp (2. 20) indukował silne i zależne od dawki wytwarzanie rodników tlenowych (anion ponadtlenkowy) w monocytach (Figura 1, b i c). Przebieg w czasie i wielkość odpowiedzi były porównywalne z tymi wywoływanymi przez fMLF (Figura 1b, wkładka). Wywołane przez Hp (2. 20). Tworzenie anionu ponadtlenkowego było hamowane przez inhibitor NADPH-oksydazy DPI (18). Zaobserwowano ponad 90% hamowania aktywności indukowanej przez Hp (2 . 20) 3 przy stężeniu DPI wynoszącym 10 .M. W równoległych eksperymentach DPI hamowało tworzenie rodników tlenowych w odpowiedzi na fMLF, ustalony aktywator NADPH-oksydazy (17) o podobnej skuteczności i mocy (nie pokazano). Te wyniki sugerują, że Hp (2. 20) jest prawdziwym aktywatorem monocytowej NADPH-oksydazy. Figura 1Hp (2. 20) indukowana chemotaksja monocytów i aktywacja monocytowej NADPH-oksydazy. Przenikanie monocytów po 90 minutach w odpowiedzi na różne stężenia Hp (2. 20) określono za pomocą układu komory wielozawałowej ChemoTx. Migracja została określona mikroskopowo poprzez zliczanie komórek w dolnych przedziałach
[patrz też: sympozjum diabetologiczne zakopane 2015, gimnastyka korekcyjna zestaw ćwiczeń, ergonomia stanowiska pracy biurowej ]
[podobne: młody jęczmień a odchudzanie forum, poradnia laryngologiczna olsztyn, ergonomia stanowiska pracy biurowej ]