Promowanie przeżycia osteoklastów i antagonizmu apoptozy osteoklastów wywołanej bisfosfonianami przez glukokortykoidy cd

Połowa pożywki była wymieniana co 5 dni. Kolonie zawierające osteoblasty wizualizowano za pomocą barwienia Von Kossa. Replikację CFU-OB in vitro określono w sposób opisany wcześniej (23). Jedną porcję komórek użyto do określenia liczby CFU-OB na 106 komórek szpiku w początkowym izolacie, jak opisano powyżej. Drugą porcję użyto do ustalenia replikowanych hodowli komórek w żelach kolagenowych typu I w 5 x 106 komórek w ml żelu, które następnie utrzymywano pod nieobecność lub bez obecności 10 nM prednizolonu przez 7 dni. Komórki następnie zdyspergowano za pomocą bakteryjnej kolagenazy i określono liczbę CFU-OB w każdym żelu. Aby obliczyć wzrost krotności CFU-OB podczas hodowli w żelu kolagenowym, liczbę CFU-OB uzyskaną na żel (po 7 dniach hodowli) podzielono przez liczbę CFU-OB początkowo wprowadzoną do żelu kolagenowego. Liczbę progenitorów osteoklastów w izolacie szpiku określono przez współhodowanie 75 000 komórek szpiku z 8000 komórek zrębu / osteoblastów UAMS-32 przez 8 dni w dołku 2 cm2 w obecności 10% FBS w pozbawionej czerwieni fenylowej. MEM uzupełnionej 10 nM 1,25 (OH) 2D3 do stymulacji tworzenia osteoklastów, jak opisano wcześniej (24). Powtórne kultury (n = 4. 6) ustalono dla każdego zwierzęcia. Komórki osteoklastyczne zostały wymienione po wybarwieniu TRAPazy; liczono zarówno jednojądrzaste jak i wielojądrzaste komórki. Podawanie bisfosfonianów. Aby zbadać wpływ środka antyresorpcyjnego na utratę gęstości kości, która towarzyszy nadmiarowi glukokortykoidów, wstępnie traktowano myszy iniekcjami podskórnymi 0,75 mg / kg / dzień alendronianu (4-amino-1-hydroksybutylideno-1,1-bisfosfonian; uzyskane z CWGM Löwik, University Hospital, Leiden, Holandia) rozpuszczone w soli fizjologicznej lub soli fizjologicznej w monoterapii, rozpoczynające się 3 dni przed podaniem prednizolonu lub placebo, a następnie kontynuowane jako codzienne iniekcje podczas podawania glukokortykoidów. To, że dawka alendronianu jest odpowiednia, zostało wykazane w naszych poprzednich ustaleniach, że podanie jednej trzeciej tej ilości alendronianu zapobiegło wzrostowi wydalania wolnego od mocznika deoksypirydynoliny i osteokalcyny w surowicy, które występują u myszy po wycięciu jajników (25). Analiza histomorfometryczna. Kręgi lędźwiowe zostały unieruchomione, osadzone w postaci nierozkalanej w metakrylanie metylu i zabarwione jak opisano wcześniej (20-22). Badanie histomorfometryczne wykonano za pomocą komputera i tabletu digitizera (OsteoMetrics Inc., Atlanta, Georgia, USA) połączonego z Zeiss Axioscope (Carl Zeiss Inc., Thornwood, New York, USA) z przyłączem do rurki do rysowania. Tożsamość każdego okazu została ukryta przed czytnikiem histomorfometrii. Wszystkie pomiary były dwuwymiarowe, ograniczone do wtórnej spongiosa i dokonywane przy powiększeniu x 400 (apertura numeryczna 0,75). Zastosowana terminologia była zalecana przez Komitet Nomenklatury Histomorfometrii Amerykańskiego Towarzystwa Badań Kośćca i Minerałów (26). Statyczne pomiary kości gąbczastych. Powierzchnia kości gąbczastych, szerokość beleczkowa i obszar osteoidalny, obwód i szerokość zmierzono jak opisano wcześniej (20). Obwód osteoblastu wyrażono jako procent całkowitego obwodu gąbczastego, a także jako liczbę osteoblastów palisadujących osteoid na milimetr obwodu gąbczastego. Podobnie, obwód osteoklastu wyrażono jako procent całkowitego obwodu gąbczastego pokrytego osteoklastami pozytywnymi wobec TRAPazy i jako liczbę osteoklastów na milimetr obwodu gąbczastego. Stosunek osteoklastów do osteoblastów wyrażono również jako odsetek i liczbę komórek. Dynamiczne pomiary kości gąbczastych. Szybkość przyłożenia minerału obliczono jako średnią odległość między punktami środkowymi obu znaczników tetracyklin podzieloną przez czas trwania interdosu (4 dni). Obwód mineralizacji i szybkość tworzenia kości na obwód gąbczasty (mikrometr kwadratowy na mikrometr na dzień) obliczono jak opisano wcześniej (20, 21). Pomiar apoptozy w niezwyciężonych odcinkach kostnych. Apoptozę wykrywano metodą in-kodowania niczyjskiego in situ (ISEL) stosując terminalną transferazę dezoksyrybonukleotydy Klenowa (Oncogene Research Products, Cambridge, Massachusetts, USA), jak opisano poprzednio (27). Skrawki wybarwiono kontrastowo 0,5. 3% zieleni metylowej. Zatopione w plastrze odcinki kręgów pobrane od dorosłych myszy poddanych orchidektomii zastosowano jako kontrolę pozytywną. Pominięcie przeniesienia wywołało negatywne kontrole. Apoptotyczne osteoblasty zidentyfikowano jako komórki dodatnie pod względem ISEL pokrywające obwód gąbczasty pokryty osteoidami. Statystyka. W teście apoptozy osteoklastów, efekty leku badano stosując jednoczynnikową ANOVA
[więcej w: skoki spadochronowe łódź, towarzystwo diabetologiczne, hemoroidy leki bez recepty ]
[podobne: trening umiejętności społecznych scenariusz, koktajl z natki pietruszki, hemoroidy leki bez recepty ]