Promowanie przeżycia osteoklastów i antagonizmu apoptozy osteoklastów wywołanej bisfosfonianami przez glukokortykoidy ad

Pomimo wczesnego niepowodzenia w zapobieganiu utracie masy kostnej i zmniejszeniu liczby osteoklastów, podawanie bisfosfonianów zapobiegło indukowanej glukokortykoidami apoptozie osteoblastów. Metody Zwierzęta. Użyto myszy C57Bl i Swiss Webster (Charles River Laboratories, Stone Ridge, New York, USA). W wieku 4 miesięcy samce myszy Swiss Webster były oznaczane elektronicznie (Biomedic Data System Inc., Maywood, New Jersey, USA) i trzymane w plastikowych klatkach (1 zwierzę w klatce) w standardowych warunkach laboratoryjnych z 12-godzinną ciemnością / 12 -godzina cyklu świetlnego, stała temperatura 20 ° C i wilgotność 48%. Wszystkie myszy karmiono standardową dietą gryzoni (Agway RMH 3000, Arlington Heights, Illinois, USA) zawierającą 22% białka, 5% tłuszczu, 5% błonnika, 6% popiołu, 3,5 Kcal / g, 1,0 IU witaminy D3 / g, 0,97% wapnia i 0,85% fosforu z wodą ad libitum. Zwierzęta ważono na początku i na końcu każdego eksperymentu. Wydział Nauk Laboratoryjnych i Medycyny Zwierząt Uniwersytetu Arkansas dla Medycyny (UAMS) zatwierdził protokoły. Test przeżycia osteoklastów. Komórki szpiku kostnego zebrano z kości udowej myszy C57Bl (Charles River Laboratories) i hodowano w pożywce. MEM z 10% FBS (HyClone Laboratories, Logan, Utah, USA) przez 2 dni. Nieadherentne komórki zebrano i próbki 0,2 x 106 komórek wysiano na 16-studzienkowych szkiełkach w pożywce AEMM z 10% FBS zawierającym 30 ng / ml ludzkiego rekombinowanego M-CSF (R & D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA ) i aktywator receptora 30 ng / ml liganda NF-kB (RANKL) (Amgen Inc., Thousand Oaks, Kalifornia, USA) przez 3. 4 dni. Następnie zmieniono nośnik na świeży. MEM, M-CSF i RANKL z 10% odpędzonym węglem FBS, a komórki inkubowano w trzech powtórzeniach przez godzinę z nośnikiem lub aldehydem 10. M 5 przed dodaniem 10. 7 do 10. 10 M deksametazon przez 24 godziny. Pływające komórki usunięto i przyłączone komórki utrwalono 2% paraformaldehydem przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Pływające komórki średnio około 10 na studzienkę i dołączone komórki 200. 40; w związku z tym jest mało prawdopodobne, aby wyłączenie komórek pływających wpłynęło na ocenę. Po przemyciu TBS, inkubowaniu z 3% nadtlenkiem wodoru przez 15 minut i blokowaniu 10% surowicą kozią przez 30. 60 minut, komórki inkubowano z aktywnym kaspazą-3 Ab (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornia, USA ) (1:50 w 2% surowicy koziej w TBS) przez 2 godziny, a następnie biotynylowane anty-królicze Ab przez 30 minut i barwienie immunoperoksydazą. W celu zmierzenia całkowitej liczby osteoklastów zastosowano barwienie kontrastowe kwaśną fosfatazą (TRAPaza) odporne na działanie winianu. Apoptotyczne osteoklasty zidentyfikowano jako ciemnobrązowe komórki (aktywne kaspazy dodatnie) w każdej studzience i wyrażono jako procent całkowitych osteoklastów na studzienkę. Dodatkowo, komórki inkubowano w trzykrotnym powtórzeniu przez godzinę z nośnikiem lub aldehydem 10. M 5 przed dodaniem 10. 9 M deksametazonu, 10. 8 M mifepristonu (RU 486) lub obu w ciągu 24 godzin, i porcjami supernatantów z studzienki oceniano stosując substraty fluorogenne (Biomol Research Laboratories, Plymouth Meeting, Pennsylvania, USA) w celu zmierzenia aktywności enzymatycznej kaspazy-3, kaspazy-8 i kaspazy-9. Badanie gęstości kości. Zastosowano absorpcjometrię rentgenowską podwójnieenergetyczną (DEXA) w celu określenia gęstości mineralnej kości kręgosłupa (BMD) u myszy żywych, jak opisano wcześniej (21, 22). W ciągu ostatnich 3 lat współczynnik zmienności pomiaru wykonanego na pełnym mysim szkielecie z tworzywa sztucznego wynosił 1,8% (n = 202). Oznaczenia BMD przeprowadzono w odstępach 2-tygodniowych, aby zidentyfikować szczytową masę kości dorosłej myszy, która została osiągnięta między 5 a 6 miesiącem życia (20. 22). Przed rozpoczęciem eksperymentu powtórzono pomiary BMD w celu przydzielenia zwierząt do grup o równoważnych wartościach BMD kręgosłupa. Podawanie glukokortykoidów. Peletki o powolnym uwalnianiu (Innovative Research of America, Sarasota, Floryda, USA) placebo lub 2,1 mg / kg / dzień prednizolonu implantowano następnie przez 4, 10 lub 27 dni, jak opisano wcześniej (20). W przypadku dynamicznych pomiarów histomorfometrycznych w 10-dniowym punkcie czasowym, tetracyklinę HCl (30 mg / kg masy ciała) podawano dootrzewnowo 6 i 2 dni przed uśmierceniem. W momencie ofiary aspiraty szpiku kostnego uzyskano z prawej kości udowej dla hodowli komórek szpiku ex vivo, a lewą dystalną kość udową i kręgi lędźwiowe (L1-L4) przygotowano do analizy histomorfometrycznej. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe progenitorów osteoblastów i osteoklastów. Komórki szpiku kostnego uzyskano w sposób opisany uprzednio (23). Liczbę progenitorów osteoblastów (CFU-OB) w izolacie szpiku określono przez hodowlę komórek przy 2,0 x 106 komórek na studzienkę 10 cm2 przez 25-28 dni z napromienionymi komórkami odżywki świnki morskiej w pozbawionej czerwieni fenylowej. MEM zawierającej 15% wstępnie wybrane FBS i mM fosforanu askorbinowego
[podobne: jogurt naturalny przepis, polskie towarzystwo diabetologiczne, towarzystwo diabetologiczne ]
[podobne: sympozjum diabetologiczne zakopane 2015, komputerowy dobór fryzur, ptd 2015 ]