Podwójna mutacja w rodzinach z okresowym paraliżem definiuje nowe aspekty powolnej inaktywacji kanału sodowego cd

Mutacje te były nieobecne w DNA od ponad 100 niespokrewnionych zdrowych osób. Te dwa aminokwasy znajdują się w segmencie obejmującym błonę, w segmencie S5 domeny IV, i są dobrze zakonserwowane wśród wszystkich bramkowanych napięciem kanałów Na + zsekwencjonowanych do tej pory od Drosophila do człowieka (Figura 1). Figura 1Schemat dla podjednostki a podjednostki A z kanałem Na + mięśnia szkieletowego Na + pokazującej lokalizację naturalnie występujących mutacji opisanych dotychczas (mutacje 1. 19) i podwójną mutację (otwarte kółka) F1490L-M1493I opisane w tym badaniu. Mutacje 1, 4, 6, 7, 8 i 18 są związane z PAM; mutacje 2, 9, 12, 13, 14, 15 i 16 są związane z PC; a mutacje 3, 5, 10, 11, 17 i 19 są powiązane z HyperKPP. Dolny panel pokazuje, jak zmutowane fenyloalaniny i metioniny są dobrze konserwowane między różnymi klonowanymi kanałami Na +: ludzki mięsień szkieletowy (hSkM1), ludzki mięsień sercowy (hSkM2), mózg szczura typu II (RII), elektropaselka węgorza, gigantyczny akson kałamarnicy, TTX- oporne kanały Na + ze zwojów korzeni grzbietowych (DRG), meduzy i Drosophila para. Inaktywacja i aktywacja. Cztery konstrukty cDNA (typu dzikiego [WT], F1490L, M1493I i F1490L-M1493I) wprowadzono do wektora pRc-CMV heterologicznie wyrażanego w komórkach HEK 293 i badano stosując technikę całkowitego napięcia cęgowego. W porównaniu z prądem makroskopowym WT, zmutowane kanały wykazywały podobną kinetykę szybkiej aktywacji i inaktywacji (Figura 2). Nie zaobserwowano długotrwałego prądu po depolaryzacji 25 milisekund. Figura 2 Bieżące ślady z reprezentatywnych komórek HEK 293 wyrażających kanały WT, zmutowane kanały F1490L, M1493I lub F1490L-M1493I. Prądy Na + monitorowano w konfiguracji całokomórkowej i wywołano przez powtarzalne 25-milisekundowe kroki napięciowe w zakresie od ~ 80 do 0 mV. Potencjał utrzymywania wynosił. 120 mV. pA, picoamperes. Inaktywację stanu zamkniętego oceniono we wszystkich czterech kanałach. Figura 3 pokazuje, że podczas gdy mutant F1490L przesuwa inaktywację w stanie ustalonym w lewo (V1 / 2 = A66,3 . 0,85 mV, n = 29, P <0,001), M1493I przesuwa krzywą inaktywacji w prawo (V1 / 2 = 56,6 . 1,0 mV, n = 19, P <0,001) w porównaniu z WT (V1 / 2 = <62,1. 0,75 mV, n = 43). Jednakże krzywa inaktywacji dla podwójnego mutanta (V1 / 2 = <62,5 . 0,82 mV, n = 34, P = 0,7) jest nieodróżnialna od WT. Krzywe aktywacji zostały zmienione w inny sposób: mutacja F1490L nieznacznie, ale nie znacząco, przesunęła krzywą aktywacji w lewo (V1 / 2 = A 19,1. 0,65 mV, n = 28, P = 0,08), a M1493I przesunięty krzywa aktywacji w prawo (V1 / 2 = A 13,0 <0,89 mV, n = 21, P <0,001). Jednakże podwójny mutant F1490L-M1493I nieznacznie przesunął punkt środkowy aktywacji do potencjałów hiperpolaryzujących (WTV1 / 2 = A 177,7. 0,44 mV, n = 47; F1490L-M1493I V1 / 2 = A 20,1. 0,62 mV, n = 24, P <0,003). Łącząc krzywe inaktywacji i aktywacji, żadna z mutacji nie przewiduje znacznego zwiększenia prądów okiennych zgodnie z naszymi obserwacjami na temat prądów makroskopowych dla wszystkich kanałów w testowanych potencjałach. Zachowanie podwójnej mutacji jest unikalne, ponieważ żadna mutacja powodująca chorobę nie została dotychczas opisana za pomocą takiego zachowania. Według naszej wiedzy przynajmniej jeden z wymienionych tutaj parametrów został dotknięty we wszystkich opisanych dotychczas mutacjach powodujących chorobę. Figura 3 Krzywe aktywacji i dezaktywacji. Przewodnictwo szczytowe Na + (GNa) mierzono podczas depolaryzacji 25-milisekundowej do różnych potencjałów testowych z potencjału utrzymywania wynoszącego. 120 mV dla scharakteryzowania stanu stacjonarnego dla WT (wypełnione kółka, n = 47), F1490L (wypełnione romby; 28), M1493I (wypełnione kwadraty, n = 21) i podwójny mutant F1490L-M1493I (otwarte kółka; n = 24). GNais obliczono z zależności GNa = INa / (V. Vrev), gdzie INa jest szczytowym wewnętrznym prądem Na + podczas depolaryzacji testowej (V), a Vrev jest potencjałem odwracającym Na +. Dane są normalizowane do maksymalnej szczytowej przewodności (Gmax) i pasują do dwustanowego rozkładu Boltzmanna: GNa / Gmax = (1 + exp [(V. V1 / 2) / k]). 1, gdzie V1 / 2 jest testem potencjał dla połowy maksymalnej aktywacji Na + i k determinuje stromość zależności napięciowej. Krzywe inaktywacji naniesiono dla prądów Na + dla WT (wypełnione kółka, n = 43), F1490L (wypełnione romby; n = 29), M1493I (wypełnione kwadraty; n = 19) i podwójny mutant F1490L-M1493I (otwarte kółka; n = 34 ). Komórki trzymano przy ~ 120 mV i poddawano 200-milisekundowemu impulsowi kondycjonującemu w zakresie od ~ 120 do 0 mV, a następnie impulsowi testowemu 25 milisekund do 0 mV. Wartości są średnie. SEM. Dezaktywacja i odzyskiwanie z szybkiej inaktywacji. Aby dokładniej zbadać, w jaki sposób HyperKPP może występować w rodzinach z podwójną mutacją w segmencie S5, zbadaliśmy dezaktywację i odzyskiwanie z szybkiej inaktywacji we wszystkich czterech kanałach [hasła pokrewne: jogurt naturalny przepis, skoki spadochronowe łódź, brak szczęścia w miłości ] [patrz też: ostre zapalenie migdałków, młody jęczmień a odchudzanie forum, poradnia laryngologiczna olsztyn ]