Podwójna mutacja w rodzinach z okresowym paraliżem definiuje nowe aspekty powolnej inaktywacji kanału sodowego ad

Ludzkie komórki zarodkowej nerki (HEK) 293 hodowano i utrzymywano, jak opisano uprzednio (8) na 100-mililitrowych płytkach hodowlanych w 37 ° C poniżej 5% CO2. Technikę strącania fosforanem wapnia (17) zastosowano zarówno do przejściowej, jak i stabilnej transfekcji. Konstrukcja mutantów hSkM1, F1490L, M1493I i F1490L-M1493I. Aminokwasy znajdujące się w segmencie S5 domeny IV ludzkiego kanału Na + mięśni szkieletowych (hSkM1) zmieniono stosując metodę megaprimerycznej PCR mutagenezy ukierunkowanej (18), jak opisano poprzednio (8). Startery stosowane do pierwszej i drugiej rundy PCR podsumowano w Tabeli 1. Protokół dla pierwszej rundy PCR był: 2 minuty w 94 ° C przez jeden cykl; 20 sekund w 94 ° C, 20 sekund w 50 ° C i minuta w 75 ° C przez 30 cykli; i 5 minut w temperaturze 72 ° C przez jeden cykl. Następujący protokół zastosowano podczas drugiej rundy PCR: 2 minuty w 94 ° C przez jeden cykl, 20 sekund w 94 ° C, 20 sekund w 54 ° C i 90 sekund w 72 ° C przez 30 cykli; i 5 minut w temperaturze 72 ° C przez jeden cykl. Wszystkie reakcje PCR przeprowadzono w DNA Engine Tetrad (MJ Research, Watertown, Massachusetts, USA). Sekwencjonowanie DNA przeprowadzono przy użyciu terminatorów barwników ABI dRhodamine lub terminatorów ABI Prism BigDye i sekwencjonowania cyklicznego z użyciem polimerazy DNA Taq FS. Sekwencję DNA zebrano i analizowano w automatycznym sekwenatorze DNA ABI Prism 377 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA). Startery zsyntetyzowano na 394 zautomatyzowanym syntezatorze DNA (Perkin-Elmer Applied Biosystems) zgodnie ze standardowymi procedurami ABI. Tabela Próbki stosowane w reakcjach PCR do konstruowania zmutowanych konstruktów F1490L, M1493I i F1490L-M1493I Elektrofizjologia. Nagrania przeprowadzono w konfiguracji całokomórkowej (19) w temperaturze pokojowej (22 ° C), jak opisano wcześniej (8). Dwadzieścia cztery godziny po wysianiu stabilnych linii lub 36 godzin po transfekcji, pożywkę hodowlaną zastąpiono roztworem do kąpieli: 140 mM NaCl, 4 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 i 10 mM Na-HEPES (pH 7,3). Wewnętrzny roztwór pipety zawierał: 130 mM CsCl, 4 mM MgCl2, 2,5 mM EGTA, 5 mM NaCl i 10 mM HEPES (pH 7,3). W eksperymentach badających powolną inaktywację, CsF zastąpiono CsCl, aby poprawić długoterminową stabilność nagrań. Wyniki Ocena pacjentów. Przedstawiamy tutaj nowego pacjenta z HyperKPP w rodzinie 3744 i rodzinie (krewny 2514), z której dane kliniczne zostały opublikowane wcześniej (20). Probandem w K3744 jest 32-letni mężczyzna, który doświadczył epizodycznych ataków paraliżu i osłabienia od 15 roku życia. Ataki nie uległy pogorszeniu dzięki zimnym lub prowokacyjnym manewrom, w tym postom i odpoczynkowi. Ocena pacjenta obejmowała elektromiogram, bez chłodzenia, który wykazał miotoniczne wyładowania (dane nie pokazane). Zazwyczaj budzi się z częściowym lub uogólnionym paraliżem, który obejmuje kończyny i zwykle ustępuje w ciągu 3-5 dni. Czasami doświadcza poczucia słabości, które może trwać kilka tygodni. Klinicznie, pacjent ma bardzo małą miotonię, inną niż przerywane opóźnienie powieki, bardzo przejściową język miotonię i skurcz mięśniowy prostowników palców i mięśni poprzecznych. Analiza biopsji mięśni wykazała typowe agregaty rurowe reprezentujące zmiany sarkolemiczne i cylindryczne typu T (1). 56-letnia matka pacjenta doświadcza ataków paralitycznych, które wydają się być rzadsze z wiekiem. Jej badanie motoryczne było niezwykłe w przypadku miotonii powiek. Nawet przy chłodzeniu, miotonia nie została wywołana w rękach. Pozostałe testy jej funkcji motorycznej były normalne. Elektromiografię igłową wykonano na prawym mięśniu dwugłowym, pierwszym mięśniu grzbietowym i mięśniach przednich piszczeli. Zwiększono aktywność w miejscu podania, a u pacjenta stwierdzono zastoinowy potencjał miotoniczny we wszystkich badanych mięśniach. Miała dwa ataki porażenne, w wieku 35 lat, oba występujące po znieczuleniu ogólnym, sugerujące szczególną wrażliwość na środki znieczulające, które mogą wywołać atak w tej rodzinie. Podobny fenotyp odnotowano u pacjentów opisanych uprzednio (20) zarówno z HyperKPP jak i MH. Identyfikacja zmian nukleotydów u pacjentów. DNA. DNA od naszego pacjenta i od pacjentów opisanych uprzednio (20) amplifikowano za pomocą starterów dla genu SCN4A, jak opisano w innym miejscu (8). Odnotowano nienormalny konformer SSCP ze starterami zaprojektowanymi do amplifikacji eksonu 24. Analiza sekwencji nieprawidłowego konformera ujawniła mutacje T4545C i G4556A (dane nie pokazane) genu SCN4A, które przewidują fenyloalaninę. Leucynę i metioninę. Izoleucynę w pozycjach 1490 i 1493, odpowiednio, w jednym allelu podjednostki ludzkiej Na + ludzkiego kanału szkieletowego Na +
[więcej w: koktajl z natki pietruszki, ile kalorii ma chleb żytni, ptd ]
[patrz też: trening umiejętności społecznych scenariusz, koktajl z natki pietruszki, hemoroidy leki bez recepty ]