Ludzkie fosfolambanowe null daje śmiercionośną rozszerzoną kardiomiopatię, która ujawnia zasadniczą różnicę między myszą a człowiekiem ad

Protokół został zatwierdzony przez instytucyjną komisję odwoławczą Centrum Oncare Cardiac Surgery Centre lub University of Cincinnati College of Medicine, a podmioty wyraziły pisemną świadomą zgodę. Genomowy DNA wyizolowano z krwi pełnej lub z bloków parafiny zawierających tkankę sercową. Gen PLN składa się z dwóch eksonów, a region kodujący jest całkowicie zawarty w eksonie 2 (18). Fragment 348 bp zawierający cały region kodujący PLN w eksonie 2 amplifikowano za pomocą PCR, stosując 60 ng genomowego DNA i wysokiej jakości polimerazę Taq. Startery miały sens 5 (3 -TCTCATATTTGGCTGCC-3. i antysensowny 5. -ATTGTTTTCCTGTCTGC-3. znakowane odpowiednio sekwencjami startera do przodu i do tyłu M13. Warunki były następujące: jeden cykl w 94 ° C przez 3 minuty, połączony z 30 cyklami w 94 ° C przez minutę, 46 ° C przez minutę i 72 ° C przez minutę, a następnie jeden cykl przy 94 ° C. C przez minutę, 53 ° C przez minutę i 72 ° C przez 10 minut. DNA zostało zsekwencjonowane przy użyciu zautomatyzowanej chemii barwników. Wytworzone sekwencje porównano ze zgłoszonymi ludzkimi sekwencjami PLN metodą obliczeniową, a elektroforogramy zbadano indywidualnie w celu potwierdzenia. Mutacja powoduje utratę miejsca endonukleazy restrykcyjnej Tru9I. Tak więc, w celu szybkiego skriningu, produkty PCR strawiono Tru9I, który dostarczył cztery fragmenty 147, 87, 61 i 53 bp z szablonów typu dzikiego i trzy fragmenty 234, 61 i 53 bp z homozygot T116G po 2% elektroforeza w żelu agarozowym. Mimo to udało się zsekwencjonować DNA PLN wszystkich osób z rodziny I i II. Echokardiografia. Przeprowadzono kompleksową echokardiografię 2D i dopplerowską (19). Wymiary lewej komory (grubość przegrody międzykomorowej [IVS], grubość przedniej ścianki [AW], grubość ściany tylnej [PW] i końcową średnicę skurczową lewej komory [LVESD] i średnicę rozkurczową [LVEDD]) zmierzono za pomocą echokardiografii w trybie M przy użyciu krawędź natarcia. do. krawędzi natarcia. Masę lewej komory (LVM) określono za pomocą wzoru Troya: LVM (g) = 1,05 [(LVEDD + IVS + PW) 3. LVEDD3] (19). Transport Ca2 + i immunofluorescencja w komórkach HEK-293. Mutagenezę cDNA PLN przeprowadzono jak opisano wcześniej (20, 21). Dziki cDNA typu dzikiego i zmutowany zligowano z miejscami Xbal i Sali wektora ekspresyjnego pMT2 w celu amplifikacji, a DNA plazmidowe oczyszczono przy użyciu kolumn Qiagen. PLN i cDNA SERCA2a w wektorach pMT2 kotransfekowano (8 .g każdego cDNA na płytkę, stosunek 1: 1) do ludzkich komórek zarodkowych nerki (HEK) 293, stosując metodę wytrącania fosforanem Ca2 +. Komórki zebrano 24 lub 48 godzin po transfekcji i mikrosomy przygotowano i testowano na aktywność transportową Ca2 + lub immunoblotting z monoklonalnym przeciwciałem ID11 ID (dar od Roberta Johnsona, Merck Research Laboratories, Whitehouse Station, New Jersey, USA) (21). W doświadczeniach immunofluorescencyjnych komórki HEK-293 hodowano na szklanych szkiełkach 18 x 18 mm i transfekowano 400 ng cDNA na 35-mm płytkę stosując Superfect (Qiagen, Mississauga, Ontario, Kanada). W 24. 48 godzin po transfekcji komórki utrwalono i poddano obróbce w kierunku immunofluorescencji za pomocą złotówki ID11 i drugiego przeciwciała skoniugowanego z izotiocyjanianem fluoresceiny (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, Pennsylvania, USA). Obrazy zebrano przy użyciu odwróconego mikroskopu Leica DM IRBE wyposażonego w laserowy system konfokalny skanujący Leica TCS SP (Leica Microsystems Inc., Richmond Hill, Ontario, Kanada). Wyrażenie genowe PLN. Northern blot całkowitego RNA sercowego (20 .g) z eksplantowanego serca probanda III-4 sondowano radioaktywnym 60-merowym oligonukleotydem, antysensownym względem ludzkiego regionu kodującego PLN. Sondowane bloty wybarwiono błękitem metylenowym w celu wykazania integralności RNA i obciążenia. Rekombinowany adenowirus. Protokół konstrukcji rekombinowanego adenowirusa opisano wcześniej (22). Pokrótce, zmutowany cDNA L39stop wklonowano do wektora wahadłowego pAdTrack-CMV (podarunek od Rogera J. Hajjara, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA), zlinearyzowano endonukleazą restrykcyjną Pmel i kotransfekowano do komórek E. coli BJ5183 (Stratagene , La Jolla, Kalifornia, USA) z plazmidem adenowirusowym pAdEasy-1 (podarunek od Bert Vogelstein, The Johns Hopkins Oncology Center, Baltimore, Maryland, USA). Rekombinanty zweryfikowano poprzez mapowanie endonukleazą restrykcyjną za pomocą PacI. Zlinearyzowany rekombinowany plazmid transfekowano do linii komórek pakujących adenowirusa (komórki HEK-293) przy użyciu Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA)
[przypisy: rezonans magnetyczny otwarty warszawa, ptd, jogurt naturalny przepis ]
[patrz też: poradnia laryngologiczna olsztyn, ergonomia stanowiska pracy biurowej, ile kalorii ma chleb żytni ]