Ludzkie fosfolambanowe null daje śmiercionośną rozszerzoną kardiomiopatię, która ujawnia zasadniczą różnicę między myszą a człowiekiem ad 5

Wartości to środki. SEM; * P <0,05. PLN-L39stop wyrażenia i lokalizacja w komórkach HEK-293. Podsumowując, powyższe wyniki wskazują, że skrócona mutacja PLN-L39stop była albo nieaktywna, albo nie wyrażona. Sugerując to drugie, produkt białkowy PLN-L37 nie mógł być wykryty w Western blot frakcji mikrosomalnych z transfekowanych komórek HEK-239 (Figura 5a, lewy panel). Jednak skrócone białko-L39-peptyd wykryto w bardzo małych ilościach w nierozpuszczalnej osadzonej frakcji z komórek homogenizowanych dounce (Figura 5a, prawy panel). To niższe białko o masie molekularnej reprezentowało monomeryczny złap-L39stop, zgodnie z wcześniej ustalonym faktem, że oligomeryzacja PLN występuje w domenie przezbłonowej (21, 26, 27). Figura 5 Ekspresja i lokalizacja mutacji PLN-WT i PLN-L39stop w komórkach HEK-293. (a) Analizy immunoblotowe mikrosomów retikulum endoplazmatycznego (lewy panel) i nierozpuszczalnych frakcji (prawy panel) uzyskane po 24 i 48 godzinach po transfekcji. Zwróć uwagę na nieobecność L39-stop w frakcji retikulum endoplazmatycznego, chociaż wykrywalne poziomy białka znajdują się we frakcji nierozpuszczalnej. PLNp, PLN pentamer; PLNm, monomer PLN. (b) Ilościowe oznaczenie liczby komórek fluorescencyjnych na szkiełkach nakrywkowych PLN-WT i PLN-L39stop. Hodowle transfekowano równymi ilościami plazmidowego DNA, a 48 godzin później zliczono liczbę komórek fluorescencyjnych na całym szkiełku nakrywkowym. (c) Immunofluorescencję transfekowanych komórek PLN-WT i PLN-L39 analizowanych metodą mikroskopii konfokalnej 48 godzin po transfekcji. W komórkach transfekowanych metodą PLN-WT immunofluorescencja znajduje się wyłącznie w retikulum endoplazmatycznym, podczas gdy wyraźnie zaznaczony wzór barwienia związanego z błoną komórkową obserwuje się w komórkach transfekowanych PLN-L39. Pasek skali, 30 .m. (d) Intensywność fluorescencji określano ilościowo przy użyciu dostępnego oprogramowania Leica. W przypadku tych testów prostą linię profilu narysowano na środku komórki i wykreślono amplitudę fluorescencji. Strzałki zaznaczają krawędź komórki, a gwiazdki zaznaczają ER. W komórkach transfekowanych PLN-WT (górny panel), immunofluorescencja znajduje się wewnątrz komórki, podczas gdy w komórkach transfekowanych PLN-L39 (dolny panel) stwierdzono wybarwianie wzbogacone na zewnętrznej krawędzi komórki. Mikroskopia konfokalna w komórkach HEK-293 transfekowanych PLN-L39stop ujawniła wykrywalne immunoreaktywne sygnały białkowe tylko 2,3% komórek fluorescencyjnych na szkiełko nakrywkowe, w porównaniu z transfektantami PLN-WT (23. 5 vs. 995. 148 komórek fluorescencyjnych na szkiełko nakrywkowe dla PLN- L39stop vs. PLN-WT, odpowiednio, P <0,0002) (rysunek 5b). Tam gdzie wykryto białko złapione w L39, jego fluorescencja była zlokalizowana głównie na błonie komórkowej (ryc. 5, c i d, dolne panele), podczas gdy obficie wyrażona PLN-WT była ograniczona do retikulum endoplazmatycznego (ryc. 5, c i d, górne panele). Aby potwierdzić te odkrycia w ludzkich sercach, wykonano analizę immunoblot mięśnia sercowego komorowego od zdrowych ludzi, myszy z knockoutem z genem PLN, eksplantowanego serca homozygotycznego pacjenta III-4 zł-L39stop i pacjenta z niezwiązaną idiopatyczną kardiomiopatią rozstrzeniową. Jak pokazano na rysunku 6a, komora homozygotyczna PLN-L39stop nie miała wykrywalnej immunoreaktywności PLN. Zgodnie z oczekiwaniami, ekspresja calsequestryny nie uległa zmianie (Figura 6a), a ekspresja SERCA2a była zmniejszona (o około 50%) zarówno u pacjentów ze stopniem L39-PLN, jak iu pacjentów z kardiomiopatią idiopatyczną (28). Zgodnie z poglądem, że defekt ekspresji był na poziomie tłumaczenia złotego lub obrotu białkiem, złoty mRNA był łatwo wykrywalny w homozygotycznym miokardium PLN-L39, choć na niższych poziomach niż w prawidłowych sercach lub sercach z kardiomiopatią idiopatyczną (Figura 6b, górny panel ). Rysunek 6SR białek i poziomy ekspresji PLN w eksplantowanej tkance serca probanda III-4 w pokrewnych I. (a) Ilościowa immunoblotting PLN, SERCA2a i calsequestrin w eksplantowanej tkance serca homozygotycznego probandu III-4, niezwiązanego z niewydolnością serca pacjenta, oraz normalny przedmiot dawcy, jak również mysz zerowa PLN. Białka wizualizowano specyficznymi przeciwciałami względem PLN, SERCA2 i calsequestryny i określano ilościowo względem standardu uzyskanego z prawidłowego serca dawcy ludzkiego. (b) obrazy autoradiograficzne z sondy Northern blot z badanym oligonukleotydem (górny panel), z użyciem RNA sercowego od zdrowych osób oraz z PLN-L39stop (III-4) i niewłogową niewydolnością serca. Znakowany radiologicznie 60-zasadowy oligonukleotyd, antysensowny względem regionu kodującego zł, rozpoznaje trzy główne złote mRNA (0,8, 1,8 i 3,0 kb). Te bloty wybarwiono błękitem metylenowym w celu zademonstrowania integralności RNA i obciążenia (dolny panel) [hasła pokrewne: rozgrzewka przed ćwiczeniami, komputerowy dobór fryzur, ostre zapalenie migdałków ] [więcej w: ptd, polskie towarzystwo diabetologiczne, identyfikator uczestnika zjazdu ]