Kluczowa rola dla komórek dendrytycznych plazmacytoidów w ochronie antywirusowej przez mikrobicyd pochwowy CpG ODNa na bazie pochwy ad 6

Odkrycia te sugerują, że oparte na CpG ODN . podejścia mikrobobójcze mogą odnieść korzyść z właściwego ukierunkowania ODN CpG na pDCs i na komórki nabłonka pochwy. Oczekuje się, że takie selektywne ukierunkowywanie ODN CpG zmniejszy ilość ODN CpG wymaganą do uzyskania skutecznej aktywności bakteriobójczej, a także zmniejszy zapalenie, które jest związane z ogólnym stosowaniem agonistów TLR (24) bez zmniejszania skuteczności ODN CpG jako środka przeciwbakteryjnego. Wreszcie, to badanie ujawnia znaczenie skomplikowanego przesłuchu pomiędzy pDC i komórkami zrębowymi pochwy w kierowaniu wrodzoną ochroną antywirusową po lokalnym dostarczaniu CpG ODN przez IFN typu I. Methods Virus and CpG ODN. HSV-2 186 syn (25) namnażano i miareczkowano, jak opisano wcześniej (16). CpG 1826 ODN (5a -TCCATGACGTTCCTGACGTT-3 .) ze szkieletem fosforotionianowym (26) zsyntetyzowano i oczyszczono metodą HPLC za pomocą TriLink BioTechnologies. Myszy i infekcja wirusowa. Samice C57BL / 6 i 129 myszy w wieku sześciu do ośmiu tygodni zakupiono od National Cancer Institute, a IL-12p40. /. myszy na tle C57BL / 6 zakupiono w Jackson Laboratory. MyD88. /. myszy (27) i TLR9. /. myszy (28) krzyżowane wstecznie na tle C57BL / 6 i IFN. R. /. myszy (29) i IFN. R. /. myszy (30) krzyżowano wstecznie na tle 129 myszy. W celu zakażenia wirusem myszy wstrzyknięto sc w kryzę szyi za pomocą Depo-Provera (Pfizer) w dawce 2 mg na mysz w objętości 100 | jl 5 dni przed zakażeniem, pobrano wymaz z alginianem wapnia i zaszczepiono dożylnie 104 PFU HSV-2. odcedzić 186 syn w objętości 10 (l za pomocą końcówki mikropipetowej o tępym końcu. W celu leczenia ODN CpG myszy zaszczepiono 100. G ODN CpG w 10. L objętości do 24 godzin przed infekcją wirusową. Ta procedura została przeprowadzona zgodnie z poprzednim raportem wykazującym, że optymalny okres ochrony wynosił od. 24 godziny do 4 godzin po traktowaniu CpG ODN (6, 31). Stopień nasilenia choroby oceniano (32) w następujący sposób: 0, brak oznak; 1, nieznaczny rumień narządów płciowych i obrzęk; 2, umiarkowane zapalenie narządów płciowych; 3, ropne zmiany narządów płciowych; 4, porażenie kończyn tylnych; 5, premoribund. Z powodu humanitarnych obaw zwierzęta zostały uśmiercone przed osiągnięciem stanu zachorowania. Wszystkie procedury zastosowane w tym badaniu były zgodne z wytycznymi federalnymi i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad zwierzętami i ich użytkowania w Uniwersytecie Yale. Budowa chimer BM. Chimeryczne myszy BM skonstruowano standardową metodą opisaną poprzednio (3). W skrócie, myszy biorcy zostały śmiertelnie naświetlone promieniowaniem 9 Gy całego ciała za pomocą promiennika Cs (Yale Cancer Center). BM uzyskano z kości udowej i piszczelowej myszy dawcy i zebrano w jałowym PBS. Komórki następnie przemyto dwukrotnie, zliczono i ponownie zawieszono w jałowym PBS w stężeniu 5,0 x 107 komórek / ml. Napromieniowane myszy biorcy rekonstytuowano za pomocą 1,0 × 1,5 × 107 komórek za pomocą wstrzyknięcia do żyły ogonowej. Przeszczepione myszy leczono antybiotykami i utrzymywano w czystym ośrodku i stosowano do eksperymentów po całkowitym odtworzeniu (> 8 tygodni). Rekonstrukcja BM została potwierdzona zgodnie z wcześniejszym opisem (3). Zbieranie wydzieliny z pochwy i miareczkowanie wirusa. Pochwowe wydzieliny pobierano od. do 5 dni po zakażeniu przez pipetowanie 20-krotnie całkowitej objętości 50. L PBS do i z pochwy. Następnie powierzchnia pochwy została pobrana dwukrotnie. Waciki pochwowe pozostawiono w popłuczynach pochwy. Miana wirusa w popłuczynach pochwy oznaczano przez infekcję konfluentnych komórek Vero przez 2 do 3 dni potrójnie, standardową metodą (16). depresja pDC, komórek NK i limfocytów T. pDC były zubożone 24 godziny przed i 24 godziny po traktowaniu CpG ODN przez wstrzyknięcie ip 500 .g anty-mPDCA-1 w objętości 500 .l PBS (szczurzy IgG2b, Miltenyi Biotec) zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki NK były zubożone 3 razy przy ~ 3, <1 i dzień po zakażeniu przez wstrzyknięcie ip 200 .g w 200 .l anty-NK1.1 (mysia IgG2a). Limfocyty T CD4 i CD8 uległy wyczerpaniu przy a3, <1 i 1, 3 i 5 dni po zakażeniu przez wstrzyknięcie ip 400 .g anty-CD4 (GK1.5, szczurzy IgG2b) i anty-CD8 (53 <6,72). , szczur IgG2a) Abs. Myszy, którym wstrzyknięto szczurzą IgG (500 .g) lub mysie IgG (200 .g) w dniu 3, <1 i dzień po infekcji, zastosowano jako kontrole. Wszystkie procedury zubożenia postępowały według standardowego protokołu, a zubożenie in vivo zostało potwierdzone przez analizę FACS splenocytów myszy leczonych Ab. Izolacja komórek z tkanek pochwowych i analiza FACS. Tkanki pochwowe od myszy traktowanych PBS lub CpG ODN wycinano i przemywano PBS jeden raz. Tkanki inkubowano z ml 2,0 U / ml Dispase II (Roche Diagnostics) roztworem PBS w 37 ° C przez godzinę. [patrz też: identyfikator uczestnika zjazdu, młody jęczmień a odchudzanie forum, sympozjum diabetologiczne zakopane 2015 ] [patrz też: sympozjum diabetologiczne zakopane 2015, komputerowy dobór fryzur, ptd 2015 ]