5 RNA-Seq identyfikuje Fhl1 jako modyfikator genetyczny w kardiomiopatii

Transkryptom podlega wielu zmianom podczas patogenezy, w tym zastosowaniu alternatywnych 5. strony startowe, które mogą wpływać na poziomy transkrypcji i wyniki. Obecne techniki sekwencjonowania RNA mogą oceniać poziomy mRNA, ale nie wykrywają gwałtownie zmian w 5. korzystanie z witryny startowej. Tutaj opracowaliśmy strategię sekwencjonowania transkryptomu, która wykrywa zmiany w całym genomie w użyciu start-site (5. RNA-Seq) i stosuje tę metodologię do identyfikacji zdarzeń regulacyjnych, które występują w kardiomiopatii przerostowej (HCM). W porównaniu z transkryptami myszy WT, 92 geny zmieniły zastosowanie start-site w mysim modelu HCM, w tym w cztero- i pół-limfocytach LIM białko (Fhl1). Wywołana przez HCM zmieniona regulacja transkrypcji Fhl1 skutkowała silną ekspresją miocytów odrębnej izoformy białka, odpowiedzi zachowanej u ludzi z kardiomiopatiami genetycznymi lub nabytymi. Genetyczna ablacja Fhl1 u myszy HCM była szkodliwa, co sugeruje, że zmiany transkrypcyjne Fhl1 zapewniają zbawienny wpływ na zestresowane miocyty w tej chorobie. Ponieważ Fhl1 jest genem kodującym chromosom X (3, indukowane stresem zmiany w jego transkrypcji mogą przyczyniać się do różnic płci w nasileniu klinicznym HCM. Nasze odkrycia wskazują, że 5. RNA-Seq ma potencjał do identyfikacji zmian w całym genomie w 5. wykorzystanie w miejscu startowym, które wiąże się z fenotypami patogennymi. Wprowadzenie Mutacje patogenne powodują szerokie zmiany w biologii komórki, częściowo poprzez wpływ na ekspresję genów. Zmiany w ekspresji genów obejmują zmianę poziomów transkrypcji i / lub różnicowanie transkryptomu przez alternatywne zastosowanie 5. miejsca startowe, alternatywne splatanie eksonów i zróżnicowane zastosowanie miejsc poliadenylacji. Zastosowanie alternatywy 5. miejsca startowe mogą wpływać na typ komórki, która wyraża gen, poziomy transkrypcji, stabilność mRNA i / lub kodowaną strukturę białkową (1-3). W ostatnim czasie opracowano kilka metod wysokowydajnego sekwencjonowania cDNA w celu zbadania transkryptomu (oznaczanego jako RNA-Seq) (4. 7). Podczas gdy te podejścia mierzą zmiany w poziomach RNA, metody oceny zmian w 5. koniec użytkowania w całym transkryptomie pozostaje ograniczony. Poniżej przedstawiamy modyfikację istniejących protokołów RNA-Seq w celu określenia oceny poziomu i struktury RNA w całym genomie, w tym ilościowych ocen 5. użycie w miejscu startowym (oznaczone 5. RNA-Seq). Stosując tę metodologię, przebadaliśmy mysi transkryptom serca w modelu kardiomiopatii przerostowej człowieka (HCM), monogennego zaburzenia wywołanego przez mutacje genów białka sarkomeru. HCM charakteryzuje się przerostem LV (tj. Zwiększoną grubością ścianki lewej komory [LVWT]), powiększeniem i dysfunkcją miocytów oraz zwiększonym włóknieniem mięśnia sercowego, ale nasilenie tych objawów i związanych z nimi objawów różni się u pacjentów. Ostatnie badania wykazały nasilony przerost LV (8), progresję choroby (9, 10) i niekorzystne wyniki, w tym nagłą śmierć sercową (11, 12), u mężczyzn niż u kobiet z HCM, informacje, które wskazują na rolę modyfikatorów genetycznych w ekspresja choroby. Korzystając z 5. RNA-Seq, zidentyfikowaliśmy 92 geny o zmienionej 5. użycie strony startowej w HCM. Spośród nich, cztery i pół domeny białek LIM (Fhl1), gen chromosomu X, miały najbardziej znaczącą zmianę w 5. wykorzystanie w miejscu startu w przerośniętych myszach LV z HCM. Gdy ablacja Fhl1 zaostrzyła kardiomiopatię u myszy HCM, proponujemy, że indukowany stresem FHL1 i cząsteczki regulatorowe, które zmieniają transkrypcję Fhl1, są modyfikatorami genetycznymi w HCM. Wyniki Najpierw zoptymalizowaliśmy metodologię konstruowania bibliotek cDNA do analizy RNA-Seq, aby zminimalizować fragmentację RNA lub cDNA, a także włączyć losowy starter heksamerowy do pełnej syntezy cDNA (Metody dodatkowe; JCI70108DS1). Po dodaniu adapterów, użyliśmy wyboru wielkości i polaryzacji cDNA, aby wzbogacić sekwencjonowanie małych fragmentów, które zawierają transkrypty z 5. końce (rysunek 1A i dodatkowe rysunki i 2). Standardowo RNA-Seq dostarcza sekwencje, które są rozmieszczone w całym genie, pozyskanie informacji o miejscu startowym może wymagać większej głębokości i kosztu sekwencji. Odwrotnie, poziomy RNA zdefiniowane w 5 (5-RNA-Seq i 5. informacje o stronie startowej bez dodatkowego sekwencjonowania. Profile ekspresji genów pochodzące z tego podejścia wykazały wysoką powtarzalność techniczną (dodatkowa postać 3). Figura 15. RNA-Seq umożliwia wrażliwą ocenę zmian w miejscu startu. (A) Dystrybucja odczytów z referencją transkrypcji (sensowna, lewa) lub nić dopełniacza (antysensowna, prawa) wykreślona w pozycjach znormalizowanych dla długości transkryptu
[więcej w: zjazd ptd 2015, gimnastyka korekcyjna zestaw ćwiczeń, ostre zapalenie migdałków ]
[podobne: hemoroidy leki bez recepty, ostre zapalenie migdałków, młody jęczmień a odchudzanie forum ]