5 RNA-Seq identyfikuje Fhl1 jako modyfikator genetyczny w kardiomiopatii cd

Chociaż ekspresja Fhl1 była zwiększona w komórkach MHC403 / + (13-krotnie, P <0,001), ten poziom był mniejszy niż 183 innych RNA LV, co podkreśla istotną różnicę między danymi uzyskanymi przez 5. RNA-Seq w porównaniu z bardziej tradycyjnym RNA-Seq. metodologie. Stosunek odczytów z 2 alternatywnych pierwszych eksonów w Fhl1 wzrósł 69-krotnie w MHC403 / + w porównaniu z sercami myszy WT (P = 4,8 × 10. 24). Profile transkrypcyjne Fhl1 (Figura 2A) ujawniły, że myszy WT stosowały podstawowe miejsce początkowe (określane tutaj jako bFhl1, bFHL1 w białku) umiejscowione 5. do alternatywnego miejsca startowego indukowanego HCM (iFhl1; iFHL1), który dominował w myszach MHC403 / +. Znormalizowane głębokości odczytu transkrypcji były podobne dla bFhl1 w sercach od myszy WT i MHC403 / +; w związku z tym znacznie zwiększona ekspresja Fhl1 w zmutowanych sercach odzwierciedlała zastosowanie miejsca startowego iFhl1. Przewiduje się, że miejsce translacji iFhl1 zawiera 16 aminokwasów (numer dostępu NCBI NP_001070830), które nie występują w transkrypcjach bFhl1. 16 aminokwasów jest wysoce konserwatywnych u ssaków, a 15 z 16 jest identycznych u myszy i ludzi (numer dostępu NCBI NP_001153171). Figura 2 Transkryptów Fhl1 w WT i MHC403 / + LV i izolowanych miocytach i nie-myocytach. (A) Zrzut ekranu przeglądarki genomu UCSC genu Fhl1, pokazujący znormalizowane głębokości odczytu znalezione w sercach WT i HCM (MHC403 / +). Pokazano struktury izoform bFhl1 i iFhl1. Zwróć uwagę na 10-krotną różnicę w skalach osi y; iFhl1 w sercach HCM wyrażono na poziomie 10-krotnie wyższym niż bFhl1 w sercach WT. (B) Produkty Fhll5. RACE frakcjonowane na żelu agarozowym potwierdziły estymaty 5. RNA-Seq poziomów bFHL1 i iFHL1. W przypadku analiz produktów PCR patrz Suplementacja Fig. 7. (C) Western blot wykazujący podwyższone poziomy iFHL1 w ekstraktach białka LV HCM. Ekstrakty (15 .l Fhll-null, 15 .g WT, 5 .g MHC403 / + na ścieżkę) frakcjonowano na 12% żelu SDS-poliakryloamidowym. Należy zwrócić uwagę na przesunięcie wielkości spowodowane dodaniem 16 aminokwasów do białka iFHL1 (~ 1,6 kDa) w porównaniu z białkiem bFHL1. (D) ekspresja iFhl1 i bFhl1 w LV, izolowanych miocytach i niemiocytach z myszy 3 WT i 3 myszy MHC403 / +. Nie wykryto transkryptów iFhl1 w niemycytach z serc WT lub MHC403 / +. Odczyty zostały znormalizowane do całkowitej liczby odczytów na milion (patrz Metody). * P <5 × 10. 6, ** P <10. 7, *** P = 2 × 10. 16, dokładny test Fishera. Aby półilościowo ocenić wykorzystanie miejsca startowego Fhl1 w sercach myszy MHC403 / + i WT myszy, wykonano 5. RACE (Figura 2B i dodatkowa Figura 6). Sekwencje dideoksy fragmentów 5. RACE potwierdziły alternatywę 5. użycie w miejscu startowym i wskazana dominująca ekspresja bFhl1 w sercach WT i iFhl1 w sercach MHC403 / + (Suplementowa Figura 7). Ocenialiśmy również ekspresję białka FHL1 za pomocą analiz Western blot lizatów sercowych. Białko FHL1 nie było wykrywane w sercach Fhl1-zerowych, ale było znacznie zwiększone w ekstraktach LV MHC403 / + LV (Figura 2C). Analiza densytometryczna Western błot (n = 3 na genotyp) wskazała, że MHC403 / + LV miał 5,3-. 0,6-krotnie zwiększone poziomy FHL1 w porównaniu z WT LV (P = 0,001). Ekstrakty LV MHC403 / + zawierały zarówno bFHL1, jak i izoformę iFHL1 o wielkości 1,6 kDa, która jest transkrybowana ze zmienionego miejsca startowego. Zgodnie z danymi 5. RNA-Seq, stosunek białka iFHL1 / bFHL1 wynosił 2,57. 0,3-krotnie wyższe w lizatach MHC403 / + niż w lizatach WT (n = 3, P = 0,03, Figura 2C). Zmieniona ekspresja Fhl1 u myszy LV MHC403 / + odzwierciedlała przede wszystkim zmiany transkrypcyjne w miocytach (Tabela uzupełniająca 1). Izolowane miocyty MHC403 / + miały wyższe poziomy Fhl1 i przeważnie transkrypty iFhl1, w przeciwieństwie do miocytów WT, które eksprymowały przede wszystkim bFhl1 (figura 2D i dodatkowa figura 8). Nieprawidłowe mysie izolowane z myszy WT lub MHC403 / + wykazywały porównywalne poziomy transkryptów bFhl1 i brak transkryptów iFhl1. Blisko spokrewniony gen Fhl2 również użył alternatywnego miejsca startowego (wynik 5. RNA-Seq, 148), ale miał obniżoną ekspresję (0.6-krotnie) w MHC403 / + w porównaniu z sercami WT. Transkrypt iFhl2, w przeciwieństwie do iFhl1, nie kodował różnych aminokwasów (dodatkowa Figura 6). Ponadto zmiany transkrypcyjne w Fhl2 wystąpiły głównie w niemycytach, które miały zwiększoną ekspresję iFhl2, podczas gdy miocyty ulegały ekspresji głównie bFhl2 (dane nie pokazane). Postawiliśmy hipotezę, że indukcja izoformy iFhl1 może mieć funkcjonalne role w odpowiedziach miocytu na mutacje HCM. Aby rozwiązać ten problem, skrzyżowaliśmy myszy Fhl1 wyrażające lacZ pod endogennym promotorem Fhl1 (18) myszami MHC403 / +. Ponieważ Fhl1 jest kodowany na chromosomie X, badaliśmy myszy hemizygotyczne (Fhl1lacZ) i homozygotyczne samice (Fhl1lacZ / lacZ). LVWT dorosłych myszy i samic myszy Fhl1-null było porównywalne do kontroli WT. Ponieważ samice myszy MHC403 / + wykazują mniejszą LVWT i histopatologiczne objawy HCM niż samce myszy MHC403 / + (13), spodziewaliśmy się zmian specyficznych dla płci w ablacji Fhl1. [więcej w: komputerowy dobór fryzur, identyfikator uczestnika zjazdu, ergonomia stanowiska pracy biurowej ] [przypisy: gimnastyka korekcyjna zestaw ćwiczeń, skoki spadochronowe łódź, rozgrzewka przed ćwiczeniami ]