5 RNA-Seq identyfikuje Fhl1 jako modyfikator genetyczny w kardiomiopatii ad

Algorytm oceny zmian w rozkładzie w miejscach startu genów. (C) Dystrybucja 92 genów ze znaczącymi (P <0,05) zmianami w miejscu HCM w miejscu początkowym. Fhl1 miał najbardziej solidną zmianę (patrz tabela dodatkowa 2). Aby zidentyfikować różnice w korzystaniu z witryny początkowej, opracowaliśmy podejście obliczeniowe, które wykryło różnice w zakresie odczytu głębokości w regionach genowych miejsca startu oraz ilościowe określenie zakresu zmiany użycia w punkcie początkowym (rysunek 1B i metody dodatkowe). Suma wystąpień z wykrytymi zmianami w 5. końce przekształcono w wynik 5. RNA-Seq dla każdego genu (numer akcesyjny GEO GSE52038). Ten wynik uwzględnia tylko zmiany w rozkładzie odczytu na 5. końce RNA, znormalizowane dla zmian ekspresji genów, tak, że geny z dużymi zmianami ekspresji i brakiem zmian w rozkładzie odczytu przy 5. końce otrzymują niższy wynik. Tak więc, wynik 5. RNA-Seq szereguje geny o zmienionym użyciu start-site. Zidentyfikowano również geny z tylko jednym uprzednio zdefiniowanym miejscem startowym, które wykazywały dodatkowe nowe miejsca startu, ponieważ wykrycie przesunięcia miejsca startu transkryptu nie było zależne od wcześniejszej adnotacji (Figura 1B). To podejście bioinformatyczne zostało zaimplementowane w serii skryptów PERL połączonych w jeden pakiet oprogramowania o otwartym kodzie z konfigurowalnymi parametrami, które dają obliczenia profili ekspresji genów, kwantyfikację 5. zmiany i narzędzie do wizualizacji profili odczytu (Oprogramowanie dodatkowe). Użyto 5. RNA-Seq do oceny programu transkrypcji w sercach myszy MHC403 / +, które niosą ludzką mutację mysi HCM, Arg403Gln, w genie łańcucha ciężkiego miozyny (13. 15). Dorosłe samce myszy MHC403 / + rekapitulują histopatologiczne objawy ludzkiego HCM. Ekspresja 5132 genów uległa znaczącej zmianie u męskiego MHC403 / + względem WT LV (4 641 zwiększone, 491 zmniejszone, GEO nr dostępu GSE52038). Aby ocenić dokładność pomiaru poziomów RNA przy użyciu 5. RNA-Seq, porównaliśmy te dane z tymi uzyskanymi za pomocą uprzednio zatwierdzonej metody (16, 17), głębokiej analizy sekwencji ekspresji genów (DSAGE, Supplemental Figure 4). Zaobserwowaliśmy silną korelację (r = 0,9) dla zestawów danych generowanych przez każdą z metod, w tym transkrypty o niskiej zawartości. Przeglądarka UCSC Genome definiuje 8000 adnotowanych genów myszy z więcej niż startowym miejscem transkrypcji (Metody dodatkowe). Ogólna ocena wykorzystania miejsca startu w MHC403 / + LV ujawniła 92 geny z wynikiem 5. RNA-Seq. 20, co wskazuje na znaczące zmiany w wykorzystaniu miejsca startu w transkrypcji w porównaniu z WT LV. Około 30% tych genów zostało opisanych jako posiadające tylko miejsce inicjacji (Figura 1C i Tabela Uzupełniająca 1). 52 z 92 genów ze zmienionym użyciem start-site w komórkach MHC403 / + również miało znaczące różnice (zmiana krotki> 1,5 lub <0,67 i P <0,001) w poziomach ekspresji (44 zwiększone, 8 zmniejszone). Frakcja genów ze zmianami zarówno poziomu początkowego, jak i transkryptu była znacznie większa niż zmiany ekspresji w całym genomie (P = 5,4 × 10. 24). Analiza ontologii genów genów o zmienionych 5. miejsca startowe zidentyfikowali wiązanie aktyny i wiązanie białek cytoszkieletu jako wysoko oceniane, istotne kategorie (tabela dodatkowa 2). Wykorzystaliśmy dwie strategie do sprawdzenia 5. RNA-Seq w celu zdefiniowania alternatywnego wykorzystania strony startowej. Po pierwsze, wizualnie oceniliśmy koniec sparowanego odczytu w 800 genach z wynikiem 5. RNA-Seq. 20 (numer dostępu GEO GSE52038) i potwierdzono, że odpowiadały one alternatywnym startowym terenom transkrypcyjnym opisanym w przeglądarce Genomu UCSC i / lub demonstrowane. ciągłość z innym eksonem w tym samym genie. Kolejność rang 5-RNA-Seq znacznie przewyższała przewidywane użycie alternatywnego miejsca startowego (P = 1,1 × 10. 11, analiza krzywej charakterystyki pracy odbiornika [ROC], Supplemental Figure 5). Po drugie, wykonaliśmy 5. szybka amplifikacja końców cDNA (5. RACE, patrz Metody) na 5 genach z punktami 5. RNA-Seq między 30 a 257 (Suplementowa Figura 6) i sprawdzono alternatywne użycie start-site w każdym z nich. Aby ustalić, czy 92 geny o zmienionej 5. miejsca startowe w sercach MHC403 / + odzwierciedlały zmiany regulacyjne w obrębie miocytów, które eksprymują zmutowane białko sarcomper, lub raczej w nie-miocytach, które następnie proliferują i przyczyniają się do zwiększonego zwłóknienia, przeprowadziliśmy RNA-Seq na izolowanych populacjach komórek. 12 genów ulegało ekspresji przede wszystkim w miocytach, 21 było ekspresjonowanych głównie w niemycytach, a 59 wyrażano w obu (Tabela dodatkowa 1). Fhl1 miał najwyższą zmianę w 5. wykorzystanie w punkcie początkowym (69-krotne, P = 4,8 × 10. 24; 5. RNA-Seq score, 257) spośród ponad 15 000 transkryptów wyrażonych w LV [przypisy: poradnia laryngologiczna olsztyn, trening umiejętności społecznych scenariusz, brak szczęścia w miłości ] [patrz też: poradnia laryngologiczna olsztyn, ergonomia stanowiska pracy biurowej, ile kalorii ma chleb żytni ]